神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22分化及DNMT表達(dá)的影響

姜樹(shù)原 王強(qiáng) 張曉璐 劉曉蕾 謝雅彬 巴德仁貴 劉友

(1包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心 內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院)

內(nèi)因和外因共同調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在神經(jīng)細(xì)胞分化中有重要作用〔1,2〕。細(xì)胞分化伴隨著相關(guān)基因的激活與轉(zhuǎn)錄變化〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)NGF通過(guò)激活DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B，在誘發(fā)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮了關(guān)鍵作用〔4〕。也有研究發(fā)現(xiàn)了NGF的誘導(dǎo)分化作用，在細(xì)胞分化過(guò)程中NGF對(duì)于神經(jīng)元發(fā)育是必需的因子〔5〕。

DNA甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。這種調(diào)控方式主要是通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化來(lái)完成的，目前發(fā)現(xiàn)有催化活性的DNMT為DNMT1、DNMT3B、DNMT3A〔6,7〕。研究發(fā)現(xiàn)，在成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中DNMTs的激活調(diào)控著染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)〔8〕。到目前為止，尚不清楚NGF是否影響了DNA甲基化而啟動(dòng)了神經(jīng)元的分化。

HT22細(xì)胞株是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，可被用于檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的現(xiàn)象〔9,10〕。據(jù)報(bào)道，已分化的HT22細(xì)胞擁有更多有絲分裂期后的神經(jīng)元特性，如神經(jīng)突觸生長(zhǎng)和膽堿能標(biāo)志物、受體蛋白表達(dá)，而在未分化的細(xì)胞中，這些特性都不存在〔11〕。目前尚不清楚在HT22細(xì)胞分化過(guò)程中，NGF在DNMTs介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控中是否發(fā)揮作用。本研究旨在探討NGF誘導(dǎo)HT22細(xì)胞分化是否與DNA甲基化相關(guān)。

1 材料和方法

1.1材料 HT22細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；N2添加劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；佛波醇12,13-二丁酸酯、鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液和電化學(xué)發(fā)光(ECL)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；兔抗DNMT1、DNMT3A和DNMT3B多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；EpiQuik核提取試劑盒和EpiQuik DNMT活性/抑制分析超級(jí)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Epigentek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將HT22細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞分組及處理 HT22細(xì)胞分為未分化組和分化組。未分化組使用不含任何藥物的等體積DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分化組使用含有50 ng/ml NGF-β、1×N2添加劑、100 mmol/L佛波醇12,13-二丁酸酯、100 mmol/L雙丁酰環(huán)磷腺苷的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

1.4real-time PCR分析 用TRIzol試劑從HT22細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI7900系統(tǒng)進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。引物序列DNMT1 正義鏈：5′-CCTGGCTAAAGTCAAGTCCCT-3′，反義鏈：5′-GTGTGTGTTCCGTTCTCCAAG-3′；DNMT3A 正義鏈：5′-GGCCGAATTGTGTCTTGGTG-3′，反義鏈：5′-CCATCTCCGAACCACATGAC-3′；DNMT3B 正義鏈：5′-AAGCTCCCGGCTGTCTAAGA-3′，反義鏈：5′-CTGCGTGTAATTCAGAAGGCT-3′；β-actin 正義鏈：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，反義鏈：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。以β-actin的CT值做內(nèi)參，其值為△CT。目的基因mRNA的相對(duì)含量CT值通過(guò)△△CT表達(dá)，△△CT =△CT(目標(biāo)樣本)-△CT(參考樣本)。目的基因表達(dá)的變化可通過(guò)每組比較每組△△CT值進(jìn)行分析。

1.5免疫印跡檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)24 h培養(yǎng)后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入RIPA緩沖液，置于冰中10 min。提取蛋白并用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離相同量的蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，用兔抗DNMT1、DNMT3A和DNMT3B多克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)孵育〔12〕。使用ECL，ImageJ分析其灰度值。Western印跡數(shù)據(jù)以β-actin作為內(nèi)參。

1.6DNMT活性檢測(cè) 使用EpiQuik核提取試劑盒提取HT22細(xì)胞核蛋白。使用EpiQuik DNMT活性/抑制分析超級(jí)試劑盒檢測(cè)DNMT活性。將10 μg核提取物加入到富含胞嘧啶的DNA底物包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)板中，37℃孵育60 min，抗5-甲基胞嘧啶抗體識(shí)別甲基化的DNA，使用酶標(biāo)儀，450 nm定量檢測(cè)甲基化的DNA量，其含量與酶活性呈正比。

1.7細(xì)胞周期分析 用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，PBS收集并洗滌細(xì)胞2次。收集的細(xì)胞以800 r/min離心5 min，重懸于0.5 ml PBS中，4.5 ml 70%乙醇固定過(guò)夜，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入含有0.1% Triton X-100的0.1 mg/ml RNase A 和0.2 mg/ml碘化丙啶(PI)染液中，室溫避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞周期，ModFit 3.0進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1分化的HT22細(xì)胞形態(tài) 使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。未分化組HT22細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)突起長(zhǎng)度較短的紡錘狀外觀，分化組HT22細(xì)胞神經(jīng)突起總長(zhǎng)度增加(圖1箭頭)。

圖1 未分化和分化的HT22細(xì)胞形態(tài)(×100)

為了量化HT22形態(tài)學(xué)改變，采用IncuCyte測(cè)量神經(jīng)突的長(zhǎng)度和神經(jīng)突長(zhǎng)度/胞體集群。數(shù)據(jù)表明總神經(jīng)突的長(zhǎng)度和神經(jīng)突長(zhǎng)度/胞體集群數(shù)于3 h出現(xiàn)提高，于24 h顯著提高。孵育24 h，分化的細(xì)胞總神經(jīng)突的長(zhǎng)度和神經(jīng)突長(zhǎng)度/胞體集群數(shù)為6.00和0.07，而未分化的細(xì)胞為1.50和0.02，見(jiàn)圖2。

圖2 IncuCyte測(cè)定分析神經(jīng)突總長(zhǎng)度和 神經(jīng)突長(zhǎng)度/細(xì)胞團(tuán)數(shù)

2.2DNMTs mRNA和蛋白表達(dá)水平 與未分化組HT22細(xì)胞相比，分化組細(xì)胞的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。分化組DNMT1、DNMT3A蛋白質(zhì)表達(dá)較未分化組顯著增高(P<0.05)。兩組DNMT3B蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異 (P>0.05)。見(jiàn)表2，圖3。

表1 NGF對(duì)HT22細(xì)胞DNMTs mRNA 表達(dá)的影響

與未分化組比較：1)P<0.05；表2同

表2 NGF對(duì)HT22細(xì)胞DNMTs蛋白質(zhì) 表達(dá)的影響

圖3 DNMT1,3A和3B蛋白表達(dá)NGF對(duì) HT22細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

2.3DNMT活性 與未分化組細(xì)胞DNMTs活性(7.02±1.41)相比，分化組細(xì)胞DNMTs活性顯著升高(14.06±3.85，P<0.05)。

2.4細(xì)胞周期 分化組細(xì)胞與未分化組細(xì)胞的周期模式發(fā)生了變化，未分化組細(xì)胞周期分布為：G1期(54.5±0.24)%，G2期(1.88±0.95)%，S期(43.62±0.72)%；分化組：G1期(25.12±2.89)%，G2期(18.78±0.43)%，S期(56.102±2.78)%。分化組細(xì)胞G2/S期細(xì)胞數(shù)量增加。

3 討 論

NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，對(duì)細(xì)胞分化至關(guān)重要〔13〕。報(bào)道稱神經(jīng)生長(zhǎng)因子能促進(jìn)PC12細(xì)胞分化，且在促進(jìn)PC12細(xì)胞分化成神經(jīng)元細(xì)胞中具有重要作用〔14〕。與NGF促進(jìn)PC12細(xì)胞的分化作用相同，NGF誘導(dǎo)HT22細(xì)胞神經(jīng)突長(zhǎng)度的增加。本研究結(jié)果表明，NGF刺激了HT22細(xì)胞的分化。

報(bào)道稱在受NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化時(shí)，伴隨著DNMT1和DNMT3A表達(dá)的減少，DNMT3B的表達(dá)選擇性上調(diào)〔4〕，與本研究結(jié)果相反。本研究結(jié)果表明，受NGF誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的分化與DNMTs mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化及其活性的增強(qiáng)相關(guān)。