利用TALEN 系統(tǒng)對兔進行Tiki1 基因敲除

吳彩霞，劉朝明，顏泉梅，張全軍，歐陽振，趙 宇，樊娜娜，賴良學(xué)

(1 中國科學(xué)院 廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530； 2 吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

動物模型是科學(xué)研究不可缺少的工具，受到取材和倫理道德的限制，生物醫(yī)學(xué)必須依靠動物模型進行廣泛的試驗和評估。小鼠等嚙齒類作為經(jīng)典的模式動物，一些致病突變在小鼠上引起的癥狀與在人類引起的癥狀截然相反，這讓嚙齒類動物模型無法滿足人類疾病相關(guān)的研究。家兔是標準的生物醫(yī)學(xué)研究動物模型，它繁殖快，體型適中，比小鼠能更真實地模擬人類疾病的發(fā)病機制，目前已經(jīng)成為多種人類疾病模型和發(fā)育機制研究模型的首選動物。家兔疾病模型已被開發(fā)用于動脈粥樣硬化、糖尿病、脂蛋白代謝和心血管疾病[1]、骨關(guān)節(jié)炎[2]、眼病[3]、病毒感染以及癌癥等多種人類疾病的研究。家兔因其胎盤與人的相似性也經(jīng)常被用作發(fā)育生物學(xué)的研究模型[4]，比如發(fā)育毒性測試和孕期糖尿病等的相關(guān)研究[5]。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease， TALEN)技術(shù)已經(jīng)取代鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease， ZFN) 技術(shù)成為基因組定點靶向修飾的主流技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于真核細胞以及多種模式生物的科學(xué)研究中。2010 年，Sun 等[6]將全序列合成的 Tale 蛋白與 Fok I 核酸內(nèi)切酶融合組成TALEN，在人細胞系 HEK293 中對NTF3 和 CCR5 這2 個內(nèi)源基因分別進行了定點敲除，敲除效率達到了39.9%；Tong 等[7]利用 TALEN技術(shù)在大鼠胚胎干細胞中實現(xiàn)了對 BMPR2 基因的敲除；Carlson 等[8]在牛和豬中實現(xiàn)了TALEN 介導(dǎo)的多基因敲除；2013 年賴良學(xué)團隊將 TALEN 技術(shù)應(yīng)用于兔基因敲除研究，建立了世界首例免疫缺陷家兔疾病模型[9]；2014 年，Liu 等[10]通過將 3 對TALEN 的 mRNA 同時注射到食蟹猴胚胎中，成功獲得1 只Rett 綜合癥的雌性猴模型。TALEN 技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進了基因定點修飾動物的研究，為這些克隆效率低下又缺少全能胚胎干細胞物種的基因修飾開辟了新渠道。

Tiki1 基因在無翅基因 (Wingless/Int1，Wnt)信號通路中作為抑制因子而發(fā)揮作用[11]。在蛙上進行的試驗證實了Tiki1 在頭部誘導(dǎo)過程中起著決定性的作用，Tiki1 基因的表達模式與Dickkopf1(DKK1)基因和Goosecoid(Gsc)基因最為接近[12]。Tiki1 基因在小鼠上缺失，而在家兔上表達，Tiki1 基因的錯誤調(diào)控還與人類的腫瘤等疾病相關(guān)[13]。Tiki1 基因是Wnt 信號通路中新的抑制因子，Tiki1、DKK-1、Gsc 這3 個基因之間，是否存在協(xié)同的相互作用，它們非重疊的那一部分又在生物發(fā)育中扮演著什么樣的角色，這些問題都需要借助合適的動物模型進行更加深入和完整的研究。本研究擬利用TALEN 技術(shù)建立Tiki1 基因敲除兔模型，來研究Tiki1 基因在家兔發(fā)育過程中的作用，以填補Tiki1基因在哺乳動物胚胎發(fā)育功能研究上的空白。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

分子試驗相關(guān)試劑無特殊說明均購自TaKaRa公司，細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑無特殊說明均購自 Gibco公司，化學(xué)試劑無特殊說明均購自Sigma 公司。兔子為新西蘭白兔Oryctolagus cuniculus，普通級，雌性6～8 月齡，體質(zhì)量2.0～4.5 kg，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，試驗動物生產(chǎn)許可證為[SCXK(粵)2011—0015]。所有的動物試驗均按照試驗動物使用操作規(guī)程進行操作， 試驗動物使用許可證為[SYXK(粵)2010—0063]。

1.2 TALEN 質(zhì)粒設(shè)計與構(gòu)建

1.2.1 TALEN 質(zhì)粒設(shè)計 家兔Tiki1 基因的mRNA 由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)實驗室提供，mRNA長度為1 518 bp，有7 個外顯子。根據(jù)Cermak 等[14]給出的靶點設(shè)計原則，我們在Tiki1 基因上設(shè)計了4 對TALEN。

1.2.2 TALEN 的合成與組裝 按照Golden Gate TALEN 試劑盒說明書組裝如下：比照TALEN 靶點序列，分別把Golden Gate TALEN 試劑盒前10 個堿基相應(yīng)的重復(fù)可變雙殘基(Repeat-variable diresidue， RVD)以及載體pFUS_A 加入到1 個反應(yīng)體系中；把Golden Gate TALEN 試劑盒11～15 的堿基相應(yīng)的RVD 以及載體pFUS_B#15 加入到1 個反應(yīng)體系中；下游靶點序列按照同樣方式操作。

為了減少未連接成環(huán)狀的dsDNA 片段的影響，在連接后向每個體系中加入Plasmid-Safe nuclease，將DNA 片段消化掉。

1.2.3 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細胞懸液解凍后立即置于冰上。加入上述連接質(zhì)粒DNA 溶液10 μL，42 ℃水浴中熱擊90 s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3～5 min。向管中加入500 μL LB 液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)30 min。將上述菌液搖勻后取100 μL 涂布于含Amp 的篩選平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)16～24 h。每個平板挑選1～3 個白斑，進行PCR 檢測，挑選正確的克隆過夜培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒鑒定。

1.2.4 體外轉(zhuǎn)錄 獲得的TALEN 質(zhì)粒需要轉(zhuǎn)錄為mRNA 并在末端加上Ploy (A)，采用mMESSAGE kit、mMACHINE T7 和Poly(A) polymerase。具體轉(zhuǎn)錄步驟根據(jù)mMESSAGE kit 說明書操作。

1.2.5 RNA 加尾修飾 按以下順序加入用于加尾的試劑：20 μL mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra reaction、36 μL Nuclease-free water、20 μL 5×EPAP 緩沖液、10 μL 25 mmol/L MnCl2溶液、10 μL ATP溶液。

加入4 μL E-PAP 酶，輕輕混勻，37 ℃條件下孵育30～45 min，之后置于冰上。在加入E-PAP 酶前先預(yù)留出2.5 μL 的反應(yīng)混合液，作為電泳檢測是否加尾成功的對照。

1.2.6 RNA 產(chǎn)物回收 采用氯化鋁沉淀的方式回收RNA。具體步驟如下：加入50 μL 的LiCl 沉淀液體中止加尾反應(yīng)和沉淀RNA。4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集RNA 顆粒。小心去除上清，用1 mL 體積分數(shù)為70%的乙醇溶液清洗1 次，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。小心移去乙醇溶液，重懸于RNAse-free 0.1×TE 緩沖液中。利用NanoDrop-1000 檢測質(zhì)量濃度，將mRNA 稀釋到50 ng/μL，每10 μL 分裝1 管儲存于-80 ℃冰箱。

1.2.7 TALEN 的打靶效率檢測 為了驗證TALEN的打靶效率，分別以設(shè)計的4 對TALEN 轉(zhuǎn)染家兔胎兒成纖維細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，收取該細胞并提取基因組，然后擴增包含靶位點在內(nèi)的序列，并用T7EⅠ內(nèi)切酶酶切。

1.3 兔受精卵的顯微注射

1.3.1 母兔的超排和受精卵的收集 對供體母兔注射100 IU 的孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)，注射72～120 h 后與公兔合籠配種，對于配種成功的母兔進行耳緣靜脈注射100 IU 的人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)，注射18～20 h 后對母兔實施安樂死。取出卵巢和輸卵管置于預(yù)熱的1×PBS 緩沖液中，然后用沖卵液從輸卵管沖出受精卵，挑選原核期前后的受精卵置于胚胎培養(yǎng)液中，38.5 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待用。1.3.2 顯微操作針的制備 固定針的制備：固定針要求外徑為0.12 ～0.18 mm，內(nèi)徑為0.02～0.03 mm。具體操作：在酒精燈上加熱玻璃管中部，變軟后離開火焰并迅速拉開，在外徑0.12～0.18 mm 處用砂輪切斷玻璃針；然后將針安裝到鍛針儀上，鍛針端口受熱后逐漸收縮至0.02～0.03 mm，停止加熱；在距離針尖0.3～0.4 mm 處靠近加熱的玻璃球，使玻璃針受熱后彎向玻璃球，彎至30°時停止加熱。

注射針的制備：胞質(zhì)內(nèi)注射針選擇帶有玻璃芯的玻璃管，利用程序拉針儀拉制，其針尖端封口。與固定管一樣，在400 μm 左右的位置烤成約30°的彎，便于操作。

1.3.3 受精卵的RNA 顯微注射 把原核期的受精卵放置在1 個操作液滴中，用移液槍將約1 μL 的Tiki1-TALEN mRNA 沿注射針玻璃管內(nèi)壁注射到底部，待氣泡排出后，將注射針的針尖在固定針上撞開1 個開口，調(diào)節(jié)mRNA 流出的流速，可在透明帶下調(diào)節(jié)。將注射針刺入受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注入適量的Tiki1-TALEN mRNA，可以看到胞質(zhì)略有膨脹即可拔出注射針。

1.4 囊胚基因型打靶結(jié)果的鑒定

每個囊胚用5 μL 的 NP40 裂解液在 PCR 儀中進行裂解，然后進行PCR 或者巢式PCR 來擴增目的片段，并測序鑒定各基因是否打靶。測序結(jié)果顯示有2 套或2 套以上峰圖的產(chǎn)物克隆到T 載體后測序，以確定最終的基因突變情況。

1.5 Tiki1 基因敲除兔的制備

為了進一步獲得Tiki1 基因敲除兔，將50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA 注射到17 個原核期的家兔受精卵胞質(zhì)中，并將受精卵分別移植到2 只受體兔體內(nèi)，分別編號為1#和2#。統(tǒng)計仔兔出生情況，并檢測仔兔的基因突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tiki1 基因TALEN 靶位點的設(shè)計

根據(jù)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)實驗室提供的人Tiki1 基因序列，在家兔基因組序列中進行比對，找出家兔上的Tiki1 基因，選擇其最保守的第2 外顯子進行TALEN 靶位點的設(shè)計(圖1)，根據(jù)GOLD GATE TALEN 試劑盒說明書合成了4 條TALEN，分別命名為L1、L2、R1 和R2，這4 條TALEN 可以組合成4 對TALEN，TALEN 組合命名為L1R1、L1R2、L2R1 和L2R2。以此4 對TALEN 轉(zhuǎn)染家兔胎兒成纖維細胞，T7EⅠ內(nèi)切酶酶切圖如圖2 所示，從圖2 中可以看出以L1R1 組合轉(zhuǎn)染家兔胎兒成纖維細胞提取的基因組擴增的PCR 產(chǎn)物可以經(jīng)T7EⅠ內(nèi)切酶切出2 條帶，其他組合的未見明顯條帶，說明在這4 種TALEN 組合中，L1R1 打靶效率最高。因此，選擇L1R1 對家兔Tiki1 基因進行打靶研究。

圖 1 Tiki1 基因TALEN 靶位點Fig. 1 Target sites for TALEN of Tiki1 gene

圖 2 4 對TALEN 打靶效率酶切檢測電泳圖Fig. 2 Electrophoregram detecting targeting efficiency of four pairs of TALEN by enzyme digestion

2.2 注射Tiki1-TALENs mRNA 后家兔受精胚的體外發(fā)育結(jié)果

選取原核期受精胚胎，分別以10 和50 ng/μL的質(zhì)量濃度將Tiki1-TALEN mRNA 注射到處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，統(tǒng)計發(fā)育到囊胚期的受精卵，計算囊胚率，檢測注射的RNA 對胚胎發(fā)育是否存在影響。結(jié)果見表1，當以10 ng/μL的質(zhì)量濃度注射時，囊胚率為64%；當以50 ng/μL的質(zhì)量濃度注射時，囊胚率為57%；對照組以相同量的H2O 注射，囊胚率為82%。結(jié)果表明，試驗組與對照組相比囊胚發(fā)育率稍有降低，但統(tǒng)計學(xué)差異均不顯著，說明注射的mRNA 對囊胚的發(fā)育會有影響但可以忽略，而且注射mRNA 組的囊胚率都在50%以上，所以并不會影響基因修飾兔的建立。

2.3 注射Tiki1-TALEN mRNA 后家兔受精卵Tiki1 基因修飾情況

基因打靶效率檢測結(jié)果如表2 所示。注射10 ng/μL Tiki1-TALENs mRNA 后所獲得的7 個囊胚中，有1 個囊胚(14.3%)發(fā)生了基因打靶，進一步進行基因型的深度分析，發(fā)現(xiàn)該囊胚除了檢測到該基因存在堿基缺失外，還能檢測到野生型(WT)序列，為單等位基因敲除；注射50 ng/μL Tiki1-TALENs mRNA 后所獲得的8 個囊胚中，100%發(fā)生了基因打靶，進一步進行基因型的深度分析，全部都只發(fā)生了單等位基因敲除，沒有檢測到雙等位基因敲除。在以上9 個發(fā)生基因打靶的囊胚中，存在5 種基因突變方式，分別為缺失1、6、10、15 和28 bp堿基，具體突變位置見圖3。注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA 試驗組的囊胚基因修飾效率顯著高于10 ng/μL 注射組(P=0.001 4，F(xiàn)isher’s 精確檢驗)。綜上，結(jié)合囊胚率和打靶效率考慮，我們選擇以50 ng/μL 質(zhì)量濃度的Tiki1-TALEN mRNA 注射家兔受精卵制備基因打靶兔。

表 1 注射Tiki1-TALEN mRNA 后家兔胚胎的體外發(fā)育結(jié)果Table 1 Results of in vitro development of rabbit embryos after injection with Tiki1-TALEN mRNA

表 2 注射Tiki1-TALEN mRNA 后家兔受精卵Tiki1 基因修飾結(jié)果Table 2 Modified results of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA

圖 3 注射Tiki1-TALEN mRNA 后家兔受精卵Tiki1 基因的堿基突變Fig. 3 Base mutation of Tiki1 gene in fertilized eggs of rabbits after injection with Tiki1-TALEN mRNA

2.4 注射胚胎移植受體懷孕和仔兔出生結(jié)果

將50 ng/μL 的Tiki1-TALEN mRNA 注射到17 枚原核期的家兔受精卵胞質(zhì)中，分別移植到2 只受體兔體內(nèi)，共計出生3 個活的仔兔，編號為1#-1、2#-1 和2#-2(表3)。測序分析其基因型發(fā)現(xiàn)1#-1 和2#-2 仔兔在靶位點處出現(xiàn)雙峰(圖4)，說明發(fā)生了基因打靶；2#-1 仔兔測序結(jié)果為單峰(圖4)，進一步比對該測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其為WT型，說明未發(fā)生基因打靶?；厥諟y序結(jié)果在靶位點附近存在套峰的2 只仔兔(1#-1 和2#-2)的PCR產(chǎn)物，與T 載體連接測序，再與WT 序列進行比對。結(jié)果表明，對于仔兔1#-1，Tiki1 基因除了檢測到WT 型序列外，還在靶位點發(fā)生了基因敲除，具體突變方式為插入1 bp 的同時刪減了9 bp；對于仔兔2#-2，Tiki1 基因除了檢測到WT 型序列外，還在靶位點發(fā)生了基因敲除，具體突變方式為刪減22 bp(圖5)。以上結(jié)果表明，我們建立了Tiki1 基因敲除兔模型，但是這些基因敲除兔仍存在正常的Tiki1 基因序列，說明這些打靶兔可能是單基因敲除或者是嵌合體。

表 3 基因打靶仔兔出生統(tǒng)計Table 3 Birth summary of gene targeted baby rabbits

圖 4 仔兔Tiki1 基因測序峰圖Fig. 4 Sequencing peak map of Tiki1 gene in baby rabbit

圖 5 仔兔Tiki1 基因的堿基突變Fig. 5 Base mutations in Tiki1 genes of baby rabbits

3 討論與結(jié)論

Tiki1 基因是哈佛大學(xué)兒童醫(yī)學(xué)院賀熹教授團隊發(fā)現(xiàn)在Wnt 信號通路中作為抑制因子而發(fā)揮作用的一個基因，抑制其表達會導(dǎo)致蛙胚中頭部發(fā)育的缺失[11]。Tiki1 基因在小鼠體內(nèi)缺失，因而無法在小鼠體內(nèi)研究其功能，而家兔中該基因能夠表達[15]。基于Tiki1 基因的特殊性，即Tiki1 基因在嚙齒類動物，如小鼠、大鼠體內(nèi)缺失，使用小鼠作為研究人類 Tiki1 基因缺失的疾病模型這一傳統(tǒng)途徑被阻斷，而兔由于心血管系統(tǒng)與人類非常相似，因此成為研究 Tiki1 基因極佳的哺乳動物。

本研究利用自身常年做基因編輯兔的技術(shù)優(yōu)勢試圖探索Tiki1 基因?qū)ν迷缙谂咛グl(fā)育的影響。我們首先基于TALEN 系統(tǒng)設(shè)計了靶向兔Tiki1基因的打靶載體，然后分別將10 和50 ng/μL 的Tiki1-TALEN mRNA 注射到原核期的家兔受精卵胞質(zhì)中，并進行囊胚率和基因修飾效率的統(tǒng)計，檢測所設(shè)計的Tiki1-TALEN mRNA 對胚胎發(fā)育是否存在影響以及能否高效地對胚胎進行基因修飾。結(jié)果表明，當以10 ng/μL 的質(zhì)量濃度注射時，囊胚率為64%，對照組以相同量的H2O 注射，囊胚率為82%，試驗組與對照組相比囊胚發(fā)育稍差但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。當以50 ng/μL的質(zhì)量濃度注射時，囊胚率為57%，該試驗組與對照組相比囊胚發(fā)育稍差，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，說明注射的mRNA對囊胚的發(fā)育沒有明顯影響，而且后續(xù)只要在胚胎移植時多移植幾枚胚胎不影響獲得想要的基因修飾兔。注射50 ng/μL mRNA 試驗組的囊胚率(57%) 與注射10 ng/μL mRNA 試驗組的囊胚率(64%)相比影響不大，但注射50 ng/μL mRNA 試驗組的囊胚基因修飾效率(100%) 與注射10 ng/μL mRNA 試驗組的囊胚基因修飾效率(14.3%)相比顯著提高，這有助于提高后續(xù)獲得陽性的Tiki1 基因修飾兔子的效率，所以后續(xù)試驗選擇了以50 ng/μL的質(zhì)量濃度注射來高效獲得基因修飾兔，后續(xù)將進一步獲得純合子以檢測其是否影響胚胎的后期發(fā)育或者成體發(fā)育。