噻蟲嗪對褐飛虱的毒力及解毒代謝酶活性的影響

張鈺明，向 興，王學(xué)貴

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/國家級作物學(xué)教學(xué)實驗示范中心，四川 成都 611130)

褐飛虱Nilaparvata lugens 屬同翅目Homoptera飛虱科Delphacidae，食性專一，只危害水稻、野生稻等稻類[1]，具有遷飛性、發(fā)生量大、種群增長迅速、易暴發(fā)成災(zāi)、持續(xù)時間長、防治難度大等特點。常見的褐飛虱防治方法包括化學(xué)防治和生物防治，其中高效廣譜的化學(xué)防治占據(jù)主要地位，但農(nóng)藥對害蟲的天敵也同樣存在致死作用。此外，長期、大量、不合理的農(nóng)藥使用已使褐飛虱對化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了廣譜抗藥性[2]。根據(jù)近幾年來的抗性監(jiān)測結(jié)果[3]，褐飛虱已對有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類、煙堿類、苯基吡唑類及新煙堿類等多種類型的殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，且抗藥性發(fā)展迅速。目前已知的稻飛虱對各類殺蟲劑的抗性機(jī)制包括水解酶(酯酶)、谷胱甘肽、細(xì)胞色素P450s 等解毒代謝酶活性提高，乙酰膽堿酯酶等靶標(biāo)部位敏感度降低等[4-5]。因此，為延緩褐飛虱抗藥性的發(fā)展，可選擇無交互抗性的防控藥劑和在殺蟲劑中添加增效劑[6]。

噻蟲嗪是一種廣譜的新煙堿類殺蟲劑，能有效防治同翅目、鱗翅目、鞘翅目和纓翅目害蟲，且對同翅目害蟲有特效[7]。從1991 年起，噻蟲嗪被廣泛運用于亞洲各稻區(qū)稻飛虱的防控。近年來，稻飛虱對噻蟲嗪的田間抗性在抗性強(qiáng)度和地理分布上呈現(xiàn)出極大的增強(qiáng)趨勢，肖漢祥等[8]發(fā)現(xiàn)廣東田間褐飛虱種群對噻蟲嗪已達(dá)高水平抗藥性(61.0～517.8倍)。但因防治成本較低和對褐飛虱仍具有較好的防效，且褐飛虱抗噻蟲嗪種群尚未對其他殺蟲劑表現(xiàn)出明顯的交互抗性，噻蟲嗪仍為防控褐飛虱的重要藥劑品種之一。為了解噻蟲嗪對褐飛虱的解毒代謝酶活性的影響，本研究采用稻苗浸漬法，對四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所溫室褐飛虱種群和敏感種群進(jìn)行增效劑試驗及酶活性測定，以期為褐飛虱的抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

褐飛虱室內(nèi)敏感品系由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李建洪教授課題組于2017 年提供，褐飛虱田間種群2017年采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所溫室。試驗用水稻為感蟲品種TN1。

實驗室飼養(yǎng)溫度為(27±1)℃，相對濕度為70%±10%，光周期為14 h光∶10 h 暗。

1.2 試驗藥劑和試劑

φ 為98% 吡蟲啉原藥(江蘇威耳化工有限公司)；φ 為98% 噻蟲嗪原藥(河北德瑞化工有限公司)；φ 為98%噻嗪酮原藥(山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司)；φ 為98%毒死蜱原藥(湖北沙隆達(dá)股份有限公司)；φ 為10%三氟苯嘧啶乳油(美國杜邦公司)；φ 為95.9% 氟啶蟲胺腈原藥(美國陶氏益農(nóng)公司)。

胡椒基丁醚(PBO)、馬來酸二乙酯(DEM)、磷酸三苯酯(TPP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、苯基硫脲(PTU)、α-苯基磺酰氟(PMSF)、考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白、還原型輔酶II 鈉鹽(NADPH)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、還原型谷胱甘肽(GSH)、α-乙酸萘酯(α-Na)、顯色固藍(lán)BB 鹽、對硝基苯酚、對硝基苯甲醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、毒扁豆堿、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-乙酸奈酯(β-NA)，均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 毒力測定 采用稻苗浸漬法進(jìn)行毒力測定，方法參照文獻(xiàn)[9-10]。將殺蟲劑原藥用丙酮溶解作為母液，然后用0.1% (φ)Triton X-100 水溶液將母液稀釋成5 個濃度梯度的藥液；選取室內(nèi)培養(yǎng)的TN1 水稻幼苗，每組15 株，在陰涼處干燥至表面無水痕，將稻苗按藥液質(zhì)量濃度由低到高的順序浸泡30 s，以0.1% (φ) Triton X-100 水溶液為對照組；取出后晾干30 min 至稻莖上無明水，以浸濕的脫脂棉包住稻株根部放入培養(yǎng)杯中；挑取齡期一致的3 齡若蟲放入培養(yǎng)杯中，每杯15 頭，剔除機(jī)械死傷供試蟲，每處理重復(fù)3 次，處理96 h 后檢查死亡蟲數(shù)。采用SAS 軟件計算褐飛虱抗性種群及敏感種群3 齡若蟲對2 種新型殺蟲劑的毒力。常規(guī)藥劑抗性倍數(shù)參照文獻(xiàn)[11]中所提出的褐飛虱敏感基線計算，對2 種新型殺蟲劑的抗性倍數(shù)(Resistance ratio，RR)參照褐飛虱室內(nèi)敏感品系毒力測定結(jié)果計算得出。

RR=田間種群LC50/敏感品系LC50。

抗性水平分級標(biāo)準(zhǔn)為：敏感(RR≤5.0)；低水平抗性(5.0＜RR≤10.0)；中等水平抗性(10.0＜RR≤100.0)；高水平抗性(RR＞100.0)。

1.3.2 增效劑測定 參照文獻(xiàn)[10]的方法，采用稻苗浸漬法。首先用DEM 200 μg/mL、PBO 20 μg/mL 和TPP 80 μg/mL 與噻蟲嗪復(fù)配后處理稻苗。取生長一致的褐飛虱3 齡若蟲置于處理后的稻苗上，每杯15 頭試蟲，每個處理3 次重復(fù)，以單獨使用殺蟲劑處理為對照組。根據(jù)1.3.1 確定的調(diào)查時間，統(tǒng)計各處理的死亡蟲數(shù)，并按照公式計算增效倍數(shù)或增效系數(shù)(Synergism ratio，SR)。

SR=單劑對試蟲的LC50/單劑+增效劑對試蟲的LC50。

1.3.3 解毒代謝酶活性的測定 羧酸酯酶測定參照Wang 等[12]的方法。取不同處理的褐飛虱成蟲各20 頭，加入1 mL 預(yù)先冷卻的0.04 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，將混合物在冰浴下充分勻漿，10 400 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液作為粗酶，冰浴備用。在每個試管中依次加入450 μL 磷酸緩沖液、1.8 mL 3×10-4mol/L 的α-NA 溶液(含有3×10-4mol/ L 毒扁豆堿)和50 μL 稀釋后的酶液。混勻后于30 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，然后立即加入900 μL 顯色液(ρ 為1%的固藍(lán)BB 鹽溶液和ρ 為5% SDS 溶液體積比為2∶5，現(xiàn)配現(xiàn)用)，終止反應(yīng)后再向?qū)φ战M溶液中加入酶液50 μL，搖勻后靜置2 min，于600 nm(α-NA)/555 nm(β-NA)下測吸光度。試驗各處理設(shè)3 次重復(fù)，每次重復(fù)平行測定3 次。按照公式計算羧酸酯酶的活性。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定參照Wang 等[12]的方法。加入預(yù)冷的0.1 mol/L、pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液[含1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]，將混合物在冰浴下充分勻漿，10 400 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液作為粗酶，冰浴備用。以2，4-二硝基氯苯(CDNB)為底物，在酶催化下形成谷胱甘肽S-芳基復(fù)合體，在340 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰。比色皿中依次加入790 μL 0.1 mol/L pH 6.5 磷酸緩沖液、30 μL 15 mmol/L CDNB、50 μL 粗酶液和30 μL 30 mmol/L GSH(還原型谷胱甘肽)，反應(yīng)總體積為0.9 mL，迅速混勻后，在340 nm 下用時間驅(qū)動程序監(jiān)測其吸光度在2 min內(nèi)的變化，計算反應(yīng)速度。每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每重復(fù)平行測定3 次。按照公式計算谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性。

細(xì)胞色素P450s 酶活性測定參照Rose 等[13]的方法。取不同處理的褐飛虱成蟲各40 頭，加2 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液[0.11 mol/L，pH 7.6，含0.11 mmol/L DTT、0.11 mmol/L EDTA、0.11 mmol/L PMSF、0.11 mmol/L PTU 和20% (φ)甘油]冰上勻漿，勻漿液于4 ℃10 000 r/min 離心10 min，取上清液為酶液低溫儲存?zhèn)溆?；在酶?biāo)板中加入100 μL 對硝基苯甲醚(2×10-3mol/L)和90 μL 酶液，27 ℃條件下振蕩溫育3 min，再加入10 μL NADPH(9.6×10-3mol/L)開始反應(yīng)，測定D405 nm，每20 s 讀取數(shù)據(jù)1 次，持續(xù)2 min，根據(jù)公式計算細(xì)胞色素P450s酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱的解毒酶對噻蟲嗪抗性的影響

結(jié)果(圖1)表明，溫室種群的P450s 酶比活力最高，4.70×10-3IU/mg，是敏感種群的2.13 倍，而經(jīng)PBO處理后P450s 活性被明顯著抑制，僅為1.25×10-3IU/mg(圖1C)。室內(nèi)敏感品系和溫室抗性種群經(jīng)TPP 和DEM 處理后，其羧酸酯酶(圖1A)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(圖1B)活性變化不大。因此，P450s 活性增強(qiáng)對褐飛虱溫室種群的抗藥性形成起著較為重要的作用。

圖 1 不同增效劑處理下褐飛虱的解毒代謝酶活力Fig. 1 Detoxification enzyme activities of Nilaparvata lugens under different synergists

2.2 褐飛虱種群的毒力測定

結(jié)果(表1)表明，溫室種群對新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮均達(dá)到高抗水平，分別為1 902.55、277.92 和856.06 倍；對毒死蜱的抗性為低水平，為9.65 倍，對三氟苯嘧啶及氟啶蟲胺腈都表現(xiàn)為敏感。三氟苯嘧啶與吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮無交互抗性(敏感品系和溫室種群的毒力LC50的95%置信區(qū)間有重疊，差異不顯著)，與氟啶蟲胺腈則表現(xiàn)出交互抗性(敏感種群和溫室種群的毒力LC50的95%置信區(qū)間無重疊，差異顯著)。

2.3 增效劑作用測定

結(jié)果(表2)表明，增效劑DEM、PBO 和TPP 作用于敏感品系對噻蟲嗪的增效倍數(shù)分別為1.07、1.14 和1.04 倍，對溫室種群的增效倍數(shù)分別為1.40、1.99 和1.28 倍，因此PBO 作用于溫室種群對噻蟲嗪的增效最明顯。

表 1 6 種殺蟲劑對褐飛虱的毒力Table 1 The toxicities of six insecticides on Nilaparvata lugens

表 2 3 種增效劑對噻蟲嗪的增效作用Table 2 Synergistic effects of three synergists on thiamethoxam

3 結(jié)論與討論

近年來已有大量關(guān)于褐飛虱對各類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的報道，Zhang 等[14]采用稻莖浸漬法測定了8 個褐飛虱稻田種群的抗藥性，結(jié)果表明種群對吡蟲啉和噻嗪酮均表現(xiàn)為高水平抗性，抗性倍數(shù)分別為233.3～2 029.0 和147.0～1 222.0 倍，對噻蟲嗪為中、高水平抗性(25.9～159.2 倍)，對毒死蜱仍處于低、中等水平抗性(7.4～30.7 倍)。本研究結(jié)果表明，吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮對溫室褐飛虱種群均達(dá)到高抗水平，對毒死蜱仍處于低水平抗性，與肖漢祥等[8]對田間褐飛虱種群的抗性監(jiān)測結(jié)果較為接近，但新型防控藥劑氟啶蟲胺腈與三氟苯嘧啶均表現(xiàn)敏感。因此，新型防控藥劑氟啶蟲胺腈和三氟苯嘧啶輪換使用，可有效防控褐飛虱的發(fā)生。

昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性主要體現(xiàn)在殺蟲劑作用靶標(biāo)敏感性降低以及昆蟲解毒酶代謝能力增強(qiáng)2 個方面[15]。范銀君等[16]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450s 在昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗藥性中起主要作用。莊安祥[17]通過qRT- PCR 測定了吡蟲啉LD50劑量處理對褐飛虱P450s 基因表達(dá)量的影響，認(rèn)為褐飛虱抗新煙堿類殺蟲劑主要與P450s 活性增強(qiáng)有關(guān)，其次與乙酰膽堿酯酶的敏感度降低有關(guān)。張平艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)選育建立的桃蚜Myzus persicae 抗噻蟲嗪種群的羧酸酯酶及多功能氧化酶(MFO)O-脫甲基的比活力分別是敏感品系的6.12 和2.03 倍。Gao等[19]采用PBO 和TPP 處理抗噻蟲嗪的西花薊馬Frankliniella occidentalis 種群后，對噻蟲嗪有很高的增效作用，DEM 對噻蟲嗪沒有協(xié)同作用，說明西花薊馬對噻蟲嗪的抗藥性主要與羧酸酯酶以及細(xì)胞色素P450s 酶活性增強(qiáng)有關(guān)。本研究通過對褐飛虱增效劑及3 種解毒代謝酶活力測定發(fā)現(xiàn)，PBO 表現(xiàn)出明顯的增效作用和對細(xì)胞色素P450s 活性顯著的抑制作用，說明細(xì)胞色素P450s 酶參與了褐飛虱對噻蟲嗪的抗藥性機(jī)理，該結(jié)果與毛旭連[20]就灰飛虱Laodelphax striatellus 對噻蟲嗪及噻嗪酮抗藥性機(jī)理作出的研究結(jié)果相近。Sun 等[21]研究表明，P450s 基因CYP6ER1 參與了褐飛虱對噻蟲嗪的解毒代謝，但是也發(fā)現(xiàn)有另外6 個未明確作用的調(diào)控P450s 的基因(CYP408A1V2、CYP427A1、CYP6CS1、CYP4C76、CYP4DD1 和CYP417A1V2) 高度表達(dá)。Pang 等[22]的研究表明CYP6ER1 基因也涉及褐飛虱對吡蟲啉的抗藥性機(jī)理，此外Zhang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)有其他的P450s 基因，如CYP6AY1、CYP4CE1、CYP6CW1 等也參與褐飛虱對吡蟲啉的抗藥性發(fā)展。以上研究說明細(xì)胞色素P450s 在褐飛虱對新煙堿類殺蟲劑抗藥性機(jī)理中的作用值得進(jìn)一步研究。

本試驗采用稻苗浸漬法，通過對褐飛虱敏感品系和溫室種群的毒力及酶活性測定，初步明確了褐飛虱對噻蟲嗪的代謝抗藥性主要受細(xì)胞色素P450s活性增強(qiáng)影響，使用該殺蟲劑時可添加增效劑PBO 從而抑制P450s 酶活性。由于本研究僅在生物化學(xué)水平初步探究了噻蟲嗪對褐飛虱的毒力及解毒代謝酶活性的影響，其抗藥性是否與靶標(biāo)突變及體壁穿透下降等有關(guān)還需進(jìn)行深入研究。