1 株耐銅、鋅離子土霉素降解菌的篩選鑒定及特性

劉姍姍，陳玉立，洪 文，吳奇霞，盧存龍，劉愛民

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/基因疾病與健康生物醫(yī)學(xué)安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241000)

四環(huán)素類抗生素包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，是一類廣譜抗生素。近年來畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，大量四環(huán)素類抗生素以飼料的形式用于其中。四環(huán)素類抗生素已成為我國畜禽業(yè)抗生素中使用量最大的一類抗生素[1]。據(jù)報(bào)道，2007 年我國各類抗生素的年生產(chǎn)量為21 萬t，其中約46.1%應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中[1]，而2013 年我國的四環(huán)素類抗生素使用量達(dá)到1.2 萬t[2]。無論人用或是獸用抗生素進(jìn)入動(dòng)物或人體內(nèi)后，有質(zhì)量分?jǐn)?shù)約30%～90%是以母體化合物的形式直接被排出體外[3]，最終又通過施肥等方式進(jìn)入土壤環(huán)境或者通過滲漏和污水排放進(jìn)入水體環(huán)境。我國土壤[4]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[5]、地下水[6]、牛奶[7]中都有監(jiān)測到土霉素的殘留。環(huán)境中殘留的抗生素對土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和微生物活性[8]、植物生長[9]都會(huì)產(chǎn)生影響，同時(shí)也會(huì)對人體健康造成危害。當(dāng)人體內(nèi)的四環(huán)素類抗生素積累到一定程度時(shí)會(huì)造成肝和腎臟的損傷，引起過敏或中毒反應(yīng)，還會(huì)引起牙釉質(zhì)發(fā)育不全、牙齒發(fā)黃[10-11]。因此開展土霉素殘留降解的研究很有必要。

生物降解抗生素是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，相對于物理、化學(xué)方法降解抗生素，生物降解方法具有環(huán)保、簡單、高效等特點(diǎn)[12]。孟應(yīng)宏等[13]從堆肥中篩選出1 株土霉素降解菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌Pseudomonas sp.。翟輝[14]從土壤中篩選出1 株土霉素降解菌，鑒定為曲霉菌Aspergillus sp.，但國內(nèi)外關(guān)于酵母菌降解土霉素的報(bào)道較少。同時(shí)銅和鋅離子作為最常用的飼料添加劑多數(shù)隨畜禽糞便排出體外，流入自然環(huán)境中。環(huán)境中的重金屬元素對微生物抗生素抗性的形成起到了協(xié)同選擇作用，進(jìn)一步促進(jìn)抗生素抗性基因庫的穩(wěn)定、擴(kuò)大和抗性基因的傳播[15]。因此本研究旨在篩選出具有耐銅鋅離子的土霉素降解菌，并研究其降解特性，為該菌在土霉素污染環(huán)境治理中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗(yàn)樣品為安徽省蕪湖市水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水；鹽酸土霉素(C22H24O9N2·HCl)標(biāo)準(zhǔn)品購自于Solarbio公司；甲醇、乙腈和草酸購自于上海麥克林生化科技有限公司；五水硫酸銅購自于上海市試劑一廠綜合經(jīng)營公司；七水硫酸鋅購自于上海麥克林生化科技有限公司。

EDTA-Mcllvaine 緩沖液：將0.1 mol/L 的檸檬酸溶液1 000 mL 和0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉溶液625 mL 混合，制得Mcllvaine 緩沖液，并向Mcllvaine緩沖液中加入EDTA-Na260.05 g。配制EDTAMcllvaine 緩沖液所需藥品均購自于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨、高氏1 號、PDA 培養(yǎng)基[16]。篩選培養(yǎng)基：在滅過菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入土霉素母液(1 000 mg/L)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土霉素降解菌的篩選 取10 mL 樣品裝入含有90 mL 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30 ℃、150 r/min 富集培養(yǎng)24 h，吸取0.1 mL 菌液涂布在含微量銅鋅離子、土霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L的基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d，將上述平板上生長的菌落挑出接種在100 mg/L 的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，按50 mg/L 的梯度逐漸提高培養(yǎng)基中土霉素的質(zhì)量濃度至 200 mg/L，培養(yǎng)步驟同上。經(jīng)馴化后將長勢良好、菌落規(guī)則、耐高濃度土霉素的菌株挑出，接種于含50 mg/L 土霉素的篩選培養(yǎng)基上，檢測其降解土霉素的效果，同時(shí)設(shè)置不接菌的培養(yǎng)基作為對照。挑選出5 d 降解效率最高的菌株，劃線純培養(yǎng)，菌株編號，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.3.2 降解菌降解效果的測定 將土霉素母液用甲醇稀釋至0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L 等系列質(zhì)量濃度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線；向不接菌的PDA 液體培養(yǎng)基中添加土霉素標(biāo)準(zhǔn)液，制得土霉素質(zhì)量濃度為10 和40 mg/L 的溶液，同時(shí)用流動(dòng)相制得相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用島津Prominence LC-20A 型高效液相色譜儀對土霉素含量進(jìn)行檢測。取2 mL 培養(yǎng)液，向其中加入6 mL EDTAMcllvaine 緩沖液，然后分別相繼加入1 mL 正己烷，1 mL 三氯甲烷，旋渦混勻1 min，超聲30 s 使溶質(zhì)均勻，5 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，其濾液用于高效液相色譜(HPLC)分析。色譜條件為：色譜柱Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國)流動(dòng)相： 0.01 mol·L-1草酸/乙腈/甲醇(體積比為70 /20/10)；流速：0.8 mL.min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm；進(jìn)樣量：20 μL?；厥章实挠?jì)算公式為：回收率=A/As×100%(A 和As分別對應(yīng)培養(yǎng)基和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液中的土霉素峰面積)。1.3.3 降解菌的鑒定 對篩選出的降解效果較好的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。利用基因組試劑盒提取酵母基因組，用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳對基因組進(jìn)行驗(yàn)證分析，再送樣測序。18S rDNA 序列鑒定由上海通用生物技術(shù)有限公司完成。所測得的1 8 S r D N A 序列在N C B I 進(jìn)行BLAST 搜索找到相似度較高的菌株序列，利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)。

1.3.4 MIC 檢測 檢測所篩的菌株在土霉素質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、…、1 000 mg/L 的液體培養(yǎng)基中被抑制的濃度，并用培養(yǎng)基平板進(jìn)一步縮小其最低抑菌濃度(M i n i m u m i n h i b i t o r y concentration，MIC)的范圍；同樣的試驗(yàn)條件下，檢測降解菌對四環(huán)素、金霉素、氯霉素、Cu2+、Zn2+的MIC 范圍。

1.3.5 理化因素對菌株降解土霉素效果的影響 以pH、溫度、接種量、裝液量、底物質(zhì)量濃度為研究對象，研究所篩的菌株對土霉素的降解效果。以下試驗(yàn)中每個(gè)處理均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1) pH：調(diào)節(jié)pH 分別為5、6、7、8 和9，接種量為1%(φ)，裝液量50 mL，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測定含50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)液中土霉素的殘留量。

2)溫度：調(diào)節(jié)pH 為7，接種量為1%(φ)，裝液量50 mL，設(shè)置20、25、30、35 和40 ℃共計(jì)5 個(gè)溫度梯度，150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測定含50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)液中土霉素的殘留量。

在大多數(shù)情況下，Milk-run火車包括牽引車和掛靠拖車。為了實(shí)施車間Milk-run系統(tǒng)，必須選擇適合自身的火車設(shè)備，因?yàn)椴煌竞凸S的工藝設(shè)計(jì)多種多樣，可以說市場上沒有任何拖車設(shè)計(jì)是完全適合的，所以通常會(huì)使用非標(biāo)準(zhǔn)的特殊設(shè)計(jì)來運(yùn)輸料箱。選擇配送設(shè)備時(shí)必須考慮以下問題。（1）運(yùn)輸條件：運(yùn)輸物品的多樣性，公司政策（如重量）和工廠布局。（2）運(yùn)輸靈活性：裝卸的必要靈活性，承運(yùn)人/箱子的差異，路線規(guī)劃的復(fù)雜性。（3）行駛特性：轉(zhuǎn)彎周期，方向穩(wěn)定性，噪音。（4）操作要求：維護(hù)費(fèi)用，必要設(shè)備（叉車、手推車），操作簡單。

3)接種量：調(diào)節(jié)pH 為7，裝液量50 mL，接種量(φ)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測定含50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)液中土霉素的殘留量。

4)裝液量：調(diào)節(jié)pH 為7，接種量為1%(φ)，在250 mL 三角瓶中的裝液量分別為25、50、75、100和125 mL，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測定含50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)液中土霉素的殘留量。

5)底物質(zhì)量濃度：調(diào)節(jié)pH 為7，裝液量50 mL，接種量為1%(φ)，土霉素的質(zhì)量濃度分別為25、50、100、150 和200 mg/L，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測定含不同質(zhì)量濃度底物的培養(yǎng)液中土霉素的殘留量。

1.3.6 銅、鋅離子對菌株降解土霉素的影響 在含低(50 mg/L)和高(200 mg/L)質(zhì)量濃度土霉素的最適選擇培養(yǎng)基中分別添加50 mg/L 的Cu2+和Zn2+，以空白培養(yǎng)基為對照，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d。測定培養(yǎng)液中土霉素殘留量，計(jì)算土霉素的降解率。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理使用EXCEL 2010 程序和SPSS 19.0 等統(tǒng)計(jì)分析軟件。采用新復(fù)極差法(Duncan’s 法)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的形態(tài)特征

經(jīng)馴化、純化后從基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分離出1 株土霉素的高效降解菌，編號記為DJ1。在PDA 平板上DJI 菌落呈圓形，乳白色，濕潤，黏稠，易挑起(圖1a)。菌體呈橢圓形，出芽生殖(圖1b)，為酵母菌。

2.2 DJ1 菌株18S rDNA 序列鑒定及遺傳學(xué)分析

圖 1 菌株DJ1 的菌落形態(tài)(a)和顯微形態(tài)(b)Fig. 1 Colonial and microscopic morphology of strain DJ1

2.3 HPLC 法檢測土霉素的殘留量

在所建立的HPLC 方法下，土霉素的保留時(shí)間為4.96 min。結(jié)果表明在土霉素質(zhì)量濃度為0.5～80.0 mg/L 的范圍內(nèi)，各質(zhì)量濃度與其對應(yīng)的色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，進(jìn)行相關(guān)性分析后得出土霉素的回歸方程y=38 086x-14 224，決定系數(shù)R2=0.999 9。空白PDA 液體培養(yǎng)基中經(jīng)預(yù)處理后，在10 和50 mg/L 土霉素質(zhì)量濃度下的平均回收率為101.20%和91.97%，變異系數(shù)為4.93%和4.92%。

2.4 MIC 的檢測

DJ1 菌株對四環(huán)素類抗生素具有很高的耐受性，MIC 檢測均超過700 mg/L，且對土霉素、四環(huán)素和氯霉素的MIC 均在1 000 mg/L 以上。同時(shí)在銅、鋅離子質(zhì)量濃度分別為400 和500 mg/L 時(shí)才抑制生長，說明DJ1 菌對銅鋅離子也具有較高的耐受性。且在重金屬銅鋅離子與土霉素共存的二元交叉培養(yǎng)基平板上能生長，具有重金屬銅鋅與抗生素的交叉耐性。

圖 2 DJ1 菌株的18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The 18S rDNA phylogenetic tree of strain DJ1

2.5 理化因素對DJ1 菌株降解土霉素的影響

2.5.1 pH pH 對DJ1 菌株降解土霉素效果的影響如圖3 所示。在pH 5～9 的范圍內(nèi)，DJ1 對土霉素的降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其降解率分別為pH7＞pH6＞pH5＞pH9＞pH10。pH7 為最適pH，該pH 條件下降解率最高，達(dá)67.36%。這表明DJ1 菌株適宜生長的環(huán)境是中性偏酸，且酸性環(huán)境中的土霉素降解率高于堿性環(huán)境中，這可能是因?yàn)橥撩顾卦谒嵝詶l件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，部分土霉素C 環(huán)破裂，形成內(nèi)酯型異構(gòu)體，無法被檢測出[13]。同時(shí)，水體、土壤等環(huán)境的pH 范圍大多都是中性，與本試驗(yàn)的最適pH 一致，本試驗(yàn)對于環(huán)境中污染修復(fù)具有一定的意義。

圖 3 pH 對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 3 Effect of pH on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

圖 4 接種溫度對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 4 Effect of incubation temperature on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

2.5.2 溫度 溫度對DJ1 降解土霉素的效果如圖4所示。DJ1 菌株對溫度較為敏感，當(dāng)溫度在20～25 ℃時(shí)，降解率均不超過45%，之后降解率逐漸增大。當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，降解率急劇增加到90% 以上，這可能是因?yàn)楦邷丶觿×送撩顾氐淖匀环纸鈁17]。在溫度30 和35 ℃時(shí)，土霉素降解率分別為67.36%和71.30%，但當(dāng)溫度升高至35 ℃時(shí)，DJ1 菌株的生長量逐漸減少，因此在此范圍內(nèi)選擇30 ℃作為DJ1 菌株生長的最適溫度。

2.5.3 接種量 不同接種量(φ)對DJI 菌株降解土霉素效果的影響如圖5 所示。在0.5%～4.0%的范圍內(nèi)，當(dāng)接種量為1.0%時(shí)，降解率最高，為68.67%。隨著接種量的增加，DJ1 的降解率出現(xiàn)了先增加后減小的趨勢，但差異并不顯著。趙永斌[18]報(bào)道的四環(huán)素降解菌也表現(xiàn)出了相似的現(xiàn)象，其在0.5%～4.0%的范圍內(nèi)，選擇2.0%作為最佳接種量，對土霉素的降解率達(dá)66.33%。這可能因?yàn)榫w會(huì)競爭培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)所致。故在此范圍內(nèi)選取1.0%為最適接種量。

圖 5 接種量對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 5 Effect of inoculum size on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

圖 6 裝液量對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 6 Effect of substrate volume on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

2.5.4 裝液量 裝液量實(shí)際反映的是細(xì)胞混合的均勻度和需要量的多少[19]。裝液量對DJI 菌株降解土霉素的效果如圖6 所示。不同裝液量對土霉素的降解率具有一定的差異，降解率大小分別為50 mL＞75 mL＞100 mL＞125 mL＞25 mL。即在250 mL 三角瓶中裝液量為50 ～100 mL 的條件下，DJ1 降解率較高，降解率在67.36%～59.80%。初步表明該菌是兼性厭氧菌，且選取50 mL 為最適裝液量。

2.5.5 土霉素質(zhì)量濃度 獸藥國際協(xié)調(diào)委員提出土壤中的抗生素生態(tài)毒害效應(yīng)的觸發(fā)值達(dá)到100 μg/kg 時(shí)，具有一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明中國農(nóng)業(yè)土壤中殘留土霉素的含量范圍為0～8 400 μg/kg[20]，而水體殘留土霉素的濃度一般在μg/kg，甚至是ng/kg 級別。本研究中的DJ1菌對土霉素具有較高的耐受性，但綜合環(huán)境中土霉素殘留量的因素，本試驗(yàn)選取在0～200 mg/L 的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，探索DJ1 降解土霉素的效果。如圖7 所示，土霉素的降解率呈現(xiàn)一個(gè)隨底物濃度增加而逐漸升高的趨勢，當(dāng)土霉素質(zhì)量濃度為25 mg/L 時(shí)，降解率為63.14%，說明DJ1 菌株能夠耐受高質(zhì)量濃度的土霉素。且當(dāng)土霉素質(zhì)量濃度為200 mg/L 時(shí)，降解率最高，為78.83%。因此在0～200 mg/L 的范圍內(nèi)，選擇200 mg/L 為最適底物質(zhì)量濃度。

圖 7 土霉素濃度對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 7 Effect of oxytetracycline concentration on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

2.6 銅、鋅離子對DJ1 菌株降解土霉素的影響

由圖8 可知，在含有50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)基中，與沒有加銅、鋅離子的空白對照相比， Cu2+稍微促進(jìn)了DJ1 對土霉素的降解，降解率為71.58%，但效果不顯著，Zn2+則抑制了DJ1 對土霉素的降解；在含有200 mg/L 土霉素的培養(yǎng)基中， Cu2+抑制了土霉素的降解。因重金屬對微生物的生長起著重要的作用，尤其銅、鋅離子是飼料中主要的重金屬，因此這在實(shí)際應(yīng)用中很有意義。

圖 8 銅、鋅離子對DJ1 菌株降解土霉素的影響Fig. 8 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the degradation of oxytetracycline by strain DJ1

3 討論

環(huán)境中存在的重金屬離子會(huì)改變抗生素污染物的生態(tài)危害，并最終影響環(huán)境污染的治理和防護(hù)。本文從養(yǎng)殖廢水中篩選出1 株耐重金屬銅、鋅離子的土霉素降解菌C. cutaneum。從養(yǎng)殖廢水中篩選降解菌，是因?yàn)檫@類污染物殘留的抗生素會(huì)對繁殖的微生物產(chǎn)生脅迫，只有具有強(qiáng)耐受抗生素性質(zhì)的微生物才能得以生存，故更能從其中篩選出降解菌。有研究表明，光解抗生素產(chǎn)生的產(chǎn)物毒性高于親本化合物[21]，相比之下，利用真菌漆酶降解的抗生素則毒性較低[22]。故從環(huán)境角度來看，微生物降解抗生素比物理化學(xué)的過程更可取，因?yàn)樗档土丝股氐纳锘钚?。目前關(guān)于四環(huán)素類抗生素降解菌，國內(nèi)外已有些報(bào)道。Huang 等[23]從藥廠分離出降解四環(huán)素高效酵母菌，對600 mg/L 的四環(huán)素降解率最高可達(dá)83.63%。王志強(qiáng)等[24]從某污水池底泥中分離出土霉素降解菌蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。黃建鳳等[25]研究裝液量對蠟樣芽孢桿菌降解土霉素的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在250 mL 三角瓶中采用100 mL 的裝液量時(shí)的降解率比50 mL 和150 mL的都要高，此時(shí)降解率為56.2%。Qi 等[26]研究了Cu2+、Fe2+對土霉素降解的影響，結(jié)果表明Fe2+顯著促進(jìn)了土霉素的降解，而Cu2+并不明顯。而于浩等[27]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+能促進(jìn)短波單胞菌屬Brevundimonas sp.對土霉素的降解。有研究報(bào)道C. cutaneum 是一種產(chǎn)油酵母，具有降解木質(zhì)素來源抑制物及弱酸、呋喃醛、酚醛等的能力[28]，而鮮見C. cutaneum 降解土霉素的報(bào)道。本研究從pH、溫度、接種量、裝液量、底物質(zhì)量濃度等方面研究了DJ1 菌株的降解特性，探尋最適的降解條件。但在實(shí)際應(yīng)用中受到的影響因素更多，還需進(jìn)一步探討其影響機(jī)制和降解機(jī)理。本文還檢測了DJI 菌株的MIC，發(fā)現(xiàn)其對抗生素和重金屬都有較強(qiáng)的耐受性，在后續(xù)的研究中初步檢測到DJI 菌株具有tet(A)、tet(c)、tet(M)、tet(Q)這4 種耐藥基因，使其對四環(huán)素類抗生素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性(未發(fā)表數(shù)據(jù))，因此，DJ1 可作為研究抗生素和重金屬復(fù)合污染的模式菌株。

綜上所述，菌株DJ1 是一種新發(fā)現(xiàn)的能降解土霉素的微生物資源，對于保護(hù)生態(tài)平衡及對畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

1)本研究在銅、鋅離子的脅迫下篩選出1 株降解土霉素的菌株DJ1，經(jīng)18S rDNA 鑒定后為酵母菌Cutaneotrichosporon cutaneum，GenBank 登錄號為MN809497。

2)菌株DJ1 在pH7、溫度30 ℃，裝液量50 mL(使用250 mL 三角瓶)，底物質(zhì)量濃度200 mg/L，接種量為1%(φ)的條件下，培養(yǎng)5 d 后對土霉素的降解率為78.83%。在含50 mg/L 土霉素的培養(yǎng)基中，添加Zn2+抑制了土霉素的降解，在含200 mg/L 土霉素的培養(yǎng)基中，添加Cu2+抑制了土霉素的降解。

3) 菌株DJ1 對四環(huán)素類抗生素和銅、鋅離子有較高的耐性，具有重金屬銅、鋅與抗生素的交叉耐性。