基于斑馬魚模型的熊果酸治療非酒精性脂肪肝病的作用及其機制研究

范福玲，陳月琴，趙 美，劉臘梅

1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護理系，漯河 462000；2鄭州大學(xué)內(nèi)科教研室，鄭州 450001

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是肝臟脂肪代謝異常所導(dǎo)致的肝內(nèi)三酰甘油(triglyceride，TG)蓄積過多的一種病理狀態(tài)[1]，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主的臨床病理綜合征。NAFLD已成為一項發(fā)病率較高的慢性疾病，我國NAFLD發(fā)病率為24.47%～29.70%，男性發(fā)病率高于女性[2]，且發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。NAFLD常見的危險因素主要是肥胖、血脂異常、糖尿病和代謝綜合征[3]，具有發(fā)病復(fù)雜的進程特點，從一開始的“第1次打擊”導(dǎo)致的肝臟脂肪堆積；到“第2次打擊”導(dǎo)致脂肪變性的肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死最后導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化[4]。NAFLD的危害性很大，但目前并沒有研發(fā)出治療NAFLD的特效藥，NAFLD并不能被完全治愈，市場上最有效、最常見的治療藥物主要是具有降脂作用的他汀類藥物，但是他汀類藥物具有損傷神經(jīng)系統(tǒng)和肝功能的作用[5]。鑒于NAFLD的現(xiàn)狀，不少臨床研究者發(fā)現(xiàn)一些天然植物具有治療NAFLD的作用。

目前，國內(nèi)外研究己經(jīng)證實哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介導(dǎo)脂質(zhì)堆積的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是mTOR的活化。其中，動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mTOR complex 1，mTORC1)調(diào)控脂質(zhì)代謝信號及全身代謝穩(wěn)態(tài)的平衡，參與代謝疾病的發(fā)生，例如：脂肪肝。mTOR在斑馬魚體內(nèi)主要以mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和2(mTORC2)兩種形式存在，其中mTORC1參與脂肪細(xì)胞的活化，脂肪的生成和葡萄糖的攝取，mTORC2的活性與胚胎發(fā)育，細(xì)胞骨架重建,細(xì)胞遷移,蛋白質(zhì)翻譯和修飾有關(guān)[6]。mTORC參與眾多通路之一的mTORC/SREBP-1c信號通路，是調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵途徑，與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)[7]，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)作為mTOR的下游基因，主要參與脂肪合成相關(guān)基因的表達，并受胰島素、葡萄糖等因素的調(diào)控，是代謝綜合征中重要的基因調(diào)控連結(jié)點[8]，乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coAcarboxylase，ACC1)和脂肪酸合成酶(acidsynthase，F(xiàn)ASN)作為SREBP-1c的下游基因，與脂肪合成有關(guān)，從而影響NAFLD的發(fā)病。

熊果酸(ursolic acid，UA)，又名烏蘇酸，作為天然植物山楂、連翹、構(gòu)骨葉等天然植物的主要成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗微生物、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、保肝、調(diào)脂、減肥、抗動脈粥樣硬化作用[9]，并且具備活性強、安全性高、毒性低等特性。因此，越來越多地國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注UA對肝臟保護作用方面的研究，加上UA降血脂的作用近幾年被頻繁報道證實[10]，其在NAFLD方面的研究也逐漸引以為重視，有研究認(rèn)為，UA治療NAFLD的機制與脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗和氧化應(yīng)激有關(guān)[11,12]，可以說UA對NAFLD的治療涉及了其整個范圍。斑馬魚是研究發(fā)育和疾病的優(yōu)勢生物模型，具有透明、高繁殖力和發(fā)育快的特點，深受科學(xué)實驗的歡迎。其肝膽系統(tǒng)在受精后5天(dpf)時發(fā)育完全，成年斑馬魚和幼蟲斑馬魚都容易發(fā)生肝脂肪變性，已有幾種肝脂肪變性的藥理和遺傳模型在該物種中建立了起來。其中，Sapp等[13]以葡萄糖作為對照，使用4%的果糖對斑馬魚幼魚進行模型構(gòu)造，并在48 h后成功建立斑馬魚NAFLD模型，操作簡單易行，成功率高，且重復(fù)性較好。有研究結(jié)果表明，高果糖飲食可獨立誘導(dǎo)斑馬魚肝臟脂肪變性，促進肝臟脂質(zhì)堆積[14]。

斑馬魚幼魚全體通透的優(yōu)點，非常適合進行肝臟疾病的研究，在顯微鏡下可直接觀察到肝臟病理的變化。因此，為了使UA的治療研究更加清晰簡便，我們采用斑馬魚模型擬對UA進行深入的治療作用機制研究，以便為UA的療效和機制研究提供一種新型簡單的方案，也從斑馬魚模型上對UA治療NAFLD的作用及機制進行可行性的驗證。

圖1 熊果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本研究采用果糖對斑馬魚進行NAFLD模型的構(gòu)造，根據(jù)前期的實驗研究基礎(chǔ)，選取了5、10、20 μg/mL的UA作為治療斑馬魚非酒精性脂肪肝的低、中、高劑量的治療濃度，通過對各組肝臟油紅染色，體脂含量的測定和肝臟病理切片的觀察，確認(rèn)藥物對NAFLD的治療效果，再通過RT-qPCR測定mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA的含量變化，以此進一步闡釋UA對非酒精性脂肪肝斑馬魚模型的保護作用機制。

1 材料

1.1 試劑和儀器

油紅O(Sigma，美國)，蘇木素和伊紅(Sigma，美國)，無水乙醇和1，2-丙二醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國)，果糖和葡萄糖(Sigma，美國)，熊果酸(Sigma，批號為U6753，純度為98.67%)，甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)檢測試劑盒(南京建成生物制品公司，中國)，Trizol試劑(Invitrogen)，RNase ddH2O(Solarbio，北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix TaqTMⅡ(Til RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，酶標(biāo)儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司，中國)，冰凍切片機(萊卡，德國)，基因擴增儀(Bio-rad，美國)。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成，其引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列及擴增片段大小

1.2 實驗動物

野生型AB品系斑馬魚(購自上海費曦生物科技有限公司)，挑選正常雌雄成魚交配產(chǎn)卵，收集受精卵培育5天，孵化的幼魚用于實驗。飼養(yǎng)基礎(chǔ)用水為28 ℃，每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)作用為480～510 μs/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3。

1.3 斑馬魚模型的構(gòu)建及分組

將5天大的斑馬魚隨機分為4組，每組40只，分為正常對照組、模型組、熊果酸高劑量組、熊果酸中劑量組、熊果酸低劑量組，放于培養(yǎng)皿中培育。其中正常組給予3.5%葡萄糖，模型組給予3.5%果糖，將熊果酸溶解在3.5%的果糖溶液中，使其濃度達到20、10、5 μg/mL作為熊果酸高、中、低劑量組進行給藥，持續(xù)96 h。

2 方法

2.1 斑馬魚肥滿度的測定

從各組取出6尾幼魚，用1%的Tricane將幼魚進行麻醉，待檢測斑馬魚禁食24 h后，用濾紙吸干魚體表面的殘留水分，測體長(cm)、體質(zhì)量(g)、計算肥滿度(condition factor)。

肥滿度=體質(zhì)量×100/體長3

2.2 整體油紅O染色

收集斑馬魚于染色皿中，10%的多聚甲醛固定過夜，丙二醇從低濃度到高濃度(20%、50%、80%)依次進行滲透，0.5%油紅避光孵育過夜。同樣濃度丙二醇從高濃度到低濃度洗凈背景，于20%丙二醇4 ℃冰箱保存。每組隨機挑選15條，Olympus szx10體式顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性情況，并進行拍照記錄。

2.3 TG、TC含量的測定

分別從各組中隨機取40尾幼魚，按照重量(g)∶體積(μL)=1∶10加入生理鹽水并勻漿，在4 ℃，2 500 rpm條件下離心10 min，取上清液，使用甘油三酯測試盒和膽固醇測試盒測定TG和TC的含量，實驗重復(fù)3次。

2.4 肝臟蘇木素-伊紅染色(HE)染色

4%多聚甲醛固定幼魚過夜，脫水、包埋制成蠟塊標(biāo)本，4 μm厚切片后脫蠟，蘇木素染色10 min，浸入1%鹽酸酒精中分化10 s左右，之后放入伊紅染液中染色10 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察肝臟病理變化，拍照并保存。

2.5 mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA表達水平檢測

設(shè)計mTOR、SREBP-1c、ACC1、Fasn和GAPDH基因引物，見表1。分別從各組中隨機取70尾幼魚，用PBS洗凈，Trizol試劑提取總RNA，D260/D280為1.80左右。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ擴增條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min，40個循環(huán)(95 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s)，反應(yīng)結(jié)束后制備溶解曲線。采用2-ΔΔCT法分析熒光定量結(jié)果，實驗重復(fù)3次，用統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 斑馬魚肥滿度的測定

模型組體長(P<0.05)、體重(P<0.05)和BMI值(P<0.05)顯著高于對照組和熊果酸組(表2)。

表2 各組幼魚體重、體長、肥滿度的比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

3.2 斑馬魚整體油紅O染色

油紅O染色顯示相比對照組，果糖處理后的斑馬魚肝臟區(qū)域油紅O著色明顯加深，提示肝臟內(nèi)有大量的脂滴沉積，除此之外，肝臟外形呈現(xiàn)不同程度的腫大(如圖2，黃色箭頭指向肝臟)，說明果糖處理能導(dǎo)致肝脂肪變性，給與熊果酸后，肝臟染色變淺，肝臟腫大的程度減輕，說明熊果酸可改善肝臟脂肪變性和腫大現(xiàn)象。

圖2 斑馬魚整體油紅O染色

3.3 斑馬魚整體TG和TC含量的測定

與正常對照組對比，模型組斑馬魚體內(nèi)TG和TC含量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，熊果酸組TG和TC含量降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.4 斑馬魚肝組織HE染色結(jié)果

結(jié)果顯示在果糖喂養(yǎng)組相對空白組可觀察到較大的脂肪性空泡的形成，而熊果酸組相對于模型果糖組，脂肪性空泡明顯減小，肝細(xì)胞排列恢復(fù)正常，隨著熊果酸濃度的增加，肝臟脂肪性空泡減小，圖中紅色箭頭指向肝臟(圖3)。

表3 各組喂養(yǎng)96 h后幼魚體脂的變化

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖3 各組幼魚肝臟病理組織情況(×400)

3.5 斑馬魚體內(nèi)mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA的表達水平結(jié)果

與空白組對比，模型組的mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA的表達量均上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.01)，與模型組相比，熊果酸組的mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA的表達量均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05)，由此可知，熊果酸可顯著降低果糖誘導(dǎo)的NAFLD斑馬魚體內(nèi)mTOR、SREBP-1c、ACC1和Fasn mRNA的表達。

4 討論與結(jié)論

非酒精性脂肪肝病目前已成為嚴(yán)重危害人類健康的一類慢性疾病，隨著NAFLD發(fā)病率的增高，NAFLD的治療已經(jīng)逐漸被引起重視。目前認(rèn)為，NAFLD的發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。TG參與到了NAFLD脂質(zhì)代謝的異常中，肝臟是合成TG的主要部位，當(dāng)體內(nèi)的TG合成增多時，高脂飲食、高脂血癥和脂肪組織動員增加引起的游離脂肪酸進入肝臟增多，并在肝臟轉(zhuǎn)化合成TG酯，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)的堆積，從而引發(fā)NAFLD[15]。

有關(guān)報道稱[16]，熊果酸可通過降低肝臟及血清中TG、TC的含量，并抑制炎癥因子的表達，達到治療非酒精性脂肪肝的作用。在本實驗中，熊果酸可有效降低斑馬魚體內(nèi)TG、TC的含量，通過RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，熊果酸降脂主要是通過改善脂質(zhì)代謝途徑，mTOR參與體內(nèi)多種生理反應(yīng)，其中就包括脂質(zhì)代謝，有研究表示，mTOR是胰島素刺激SREBP-1c表達所必需的一個靶點受體，可直接激活SREBP-1c的表達，而mTORC1或是通過促進SREBP-1c的裂解和核蓄積來誘導(dǎo)SREBP-1c的活性[17]。在mTOR調(diào)控SREBP-1c，從而調(diào)控與脂肪合成相關(guān)的靶點基因ACC1和Fasn的表達過程中，mTOR作為肝脂肪生成的主要受體，是肝胰島素抵抗與高血糖和高血脂相關(guān)的分子機制統(tǒng)一整合的重要發(fā)展機制。SREBP-1c為調(diào)控脂質(zhì)合成的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其靶向的脂質(zhì)合成相關(guān)酶包含ACC1和Fasn。SREBP-1c、ACC1和Fasn的表達均在TG的合成中起著主要作用[18]，因此，調(diào)控mTOR的活性可以調(diào)節(jié)下游一系列脂質(zhì)合成相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄與表達，提示mTOR可能為NAFLD治療的一個潛在關(guān)鍵作用受體。

圖4 熊果酸對斑馬魚mTOR、SREBP-1c、ACC1、Fasn mRNA表達水平的影響

近幾年，斑馬魚作為一種新型的模式動物，在疾病的研究方面已愈發(fā)成熟。斑馬魚具有繁殖迅速，在胚胎和幼體時期身體透明，因此適合基于疾病表型的高通量篩選[19]。常規(guī)的動物模型，例如：大鼠、小數(shù)、豬、狗、猴，具有實驗周期長、成本高的特點，對藥物研發(fā)的進度有一定的影響，由于斑馬魚模型既有哺乳動物實驗預(yù)測性高、可比度高的優(yōu)點，也有實驗快速、高效、費用低的優(yōu)勢。因此，斑馬魚逐漸成了科學(xué)研究的理想疾病模式動物。斑馬魚NAFLD的建立，近幾年也被大量報道，Sapp等人利用果糖成功創(chuàng)建斑馬魚NAFLD模型，造模時間僅48 h，方法簡便快速，然而改方法用在小鼠模型上需要10周[20]。而高脂飼料對斑馬魚NAFLD的構(gòu)建只需要10天[21]，這一模型在大鼠模型上需要4周[22]。由此可見，斑馬魚在NAFLD模型的構(gòu)造上，相對常用的大鼠、小鼠模型，具有高速、高效的優(yōu)勢。

綜上，熊果酸對NAFLD有良好好的治療作用，治療機制與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝信號通路有關(guān)，并且這一治療效果在斑馬魚上的到了良好的驗證，也為熊果酸治療NAFLD的深入研究提供了一種簡單易行的方法。