姜黃素通過(guò)促進(jìn)ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

劉國(guó)安，靳亞?wèn)|，冉苗苗，李貴琛，楊麒勵(lì)，丁 蘭

西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730070

癌癥治療是當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，豐富的天然產(chǎn)物仍然是人們研究并尋找活性藥物的寶庫(kù)。姜黃素(curcumin，Cur)(1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮；diferuloylmethane)，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，一種脂溶性的黃色化合物，為姜科植物姜黃CurcumalongaLinn的根莖中提取到的姜黃素類化合物中含量最多的一種。姜黃粉用作香料給咖喱提供特定的風(fēng)味和黃色，具有悠久的食用歷史。早期還用來(lái)治療咬傷，燒傷和粉刺等疾病[1]。近些年發(fā)現(xiàn)具廣泛的藥理活性。姜黃素具有抗炎活性、消除自由基、抗衰老功能及對(duì)化療藥物增敏作用等[2]，并對(duì)腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子有抑制作用[3]。臨床研究顯示對(duì)多種慢性疾病包括肺病，自身免疫疾病和癌癥有效[4]，其中對(duì)其抗癌活性與機(jī)理的研究較多。大部分研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素的多種藥理活性與其抗氧化作用相關(guān)[5]，它可能在癌發(fā)生的各個(gè)階段起到抑制作用。但近些年大量研究發(fā)現(xiàn)，很多具抗氧化活性的酚類物質(zhì)在一定的條件下卻表現(xiàn)出促氧化作用，而腫瘤細(xì)胞高代謝率引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)高于正常細(xì)胞。因此利用促氧化劑進(jìn)一步升高癌細(xì)胞中的ROS，繼而殺死癌細(xì)胞成為治療癌癥的策略之一。本文檢測(cè)了姜黃素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的生長(zhǎng)抑制作用，并檢測(cè)了氧化還原指標(biāo)及凋亡信號(hào)通路，試圖揭示其作用機(jī)理。

圖1 姜黃素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，姜黃素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(lot：822A025純度：99.34%)，L型谷胱甘肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8和GKT137831購(gòu)自AbMole公司，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BestBio貝博生物有限公司，DCFH-DA熒光探針購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司，SOD酶活試劑盒、T-AOC試劑盒、GSH/GSSG測(cè)試盒、MDA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。NADPH-OX(NADPH oxidase)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自江來(lái)生物科技有限公司，NF-κB/p65單抗、Caspase-3單抗和Caspase-1單抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為新賽美生物有限公司生產(chǎn)。二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Merck公司，胎牛血清為杭州四季青生物科技公司生產(chǎn)。

超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán))，CKKX41SF倒置顯微鏡(日本東京Olympus)，IX71型熒光顯微鏡(日本東京Olympus)，基礎(chǔ)電泳儀(美國(guó)BIO-RAD)，多功能凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)，Coulter Allegra64R高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman)，BIO-RAD m680酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Costar)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清、青霉素80 U/mL及鏈霉素80 μg/mL DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞用胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，接種于6孔板培養(yǎng)24 h，分別加入5 mmol/L谷胱甘肽(glutathione，GSH)預(yù)處理1 h后或直接加入終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L的姜黃素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并拍照。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖抑制

CCK-8法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)較傳統(tǒng)的MTT法更敏感。四唑鹽WST-8是MTT類似物，細(xì)胞線粒體脫氫酶在電子載體存在時(shí)可以將WST-8還原成高水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色深淺表示細(xì)胞數(shù)多少。檢測(cè)時(shí)U87細(xì)胞以密度10×104個(gè)/mL接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入含有不同濃度姜黃素的完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后每孔加入10% CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光值。細(xì)胞生長(zhǎng)率計(jì)算公式為：生長(zhǎng)率=Ai/A0×100%，其中，Ai表示處理組的吸光值，A0表示空白對(duì)照組的吸光值。線性回歸分析計(jì)算半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.3.3 熒光顯微鏡檢測(cè)U87細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的U87細(xì)胞配制成濃度為1.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于六孔板培養(yǎng)24 h后，GSH預(yù)處理1 h或者只加入不同濃度姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后pH 7.4 PBS洗滌，加入DCFH-DA熒光探針37 ℃染色30 min，PBS洗后熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U87細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

將3 mL密度為1.5×105個(gè)/mL的U87細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，處理后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入DCFH-DA，染色后收集細(xì)胞，再以PBS洗滌后經(jīng)260目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5 酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測(cè)NADPH氧化酶活力

以1.5×105個(gè)細(xì)胞/mL接種U87細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)24 h后加不同濃度的姜黃素處理后收集細(xì)胞，反復(fù)液氮凍融使細(xì)胞破碎并釋放出細(xì)胞內(nèi)容物。3 000 rpm離心20分鐘，收集上清?？贵w夾心法酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值，計(jì)算樣品NADPH-OX濃度。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量、GSH含量、細(xì)胞總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)

將細(xì)胞以1.5×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加不同濃度姜黃素處理24 h；吸去上清并用PBS洗兩遍，細(xì)胞刮下反復(fù)凍融，BCA法測(cè)定細(xì)胞樣品蛋白濃度。測(cè)定時(shí)按各試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.7 AO/EB熒光染色法檢測(cè)U87細(xì)胞凋亡

細(xì)胞以濃度為1.5×105個(gè)/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入姜黃素或先以GSH預(yù)處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入AO/EB染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.3.8 Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24 h后加不同濃度姜黃素處理24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，YF48Annexin V和PI避光孵育處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.9 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路蛋白

接種于培養(yǎng)皿中的U87細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h之后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，裂解細(xì)胞后離心取上清以BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。常規(guī)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后一抗及二抗孵育，清洗之后的PVDF膜放于暗盒中，滴加超敏ECL(electrochemiluminescence)化學(xué)發(fā)光劑，室溫下避光60 s，凝膠圖像分析儀進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與制圖

用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件完成t檢驗(yàn)和方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，圖片用Origin 軟件制作，化學(xué)結(jié)構(gòu)式用Chemdraw繪制。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)U87細(xì)胞的毒性及GSH的抑制作用

CCK-8法檢測(cè)化合物作用于細(xì)胞24 h的增殖率可以看出(圖2)，姜黃素對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。5 μmol/L就表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，與對(duì)照組相比，各劑量細(xì)胞增殖率均顯著降低(P<0.01)，且隨著姜黃素濃度的升高，細(xì)胞增殖率逐漸下降。姜黃素濃度在5～100 μmol/L范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖率從91.68%降至36.01%，顯示細(xì)胞生長(zhǎng)率與姜黃素濃度有劑量依賴關(guān)系，回歸分析可知IC50=68.32 μmol/L。

顯微鏡下觀察U87細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化顯示(圖3)，5 μmol/L姜黃素處理組與對(duì)照組細(xì)胞相近(圖3：A和B)。10、20、40 μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞形態(tài)改變明顯(圖3：C、D、E)，顯示胞體兩端突起，呈收縮細(xì)胞增多，貼壁細(xì)胞減少，姜黃素濃度較高時(shí)細(xì)胞失去貼壁性，懸浮在培養(yǎng)基中，有些似已死亡。但10和40 μmol/L姜黃素與5 mmol/L GSH聯(lián)合處理后細(xì)胞明顯趨向正常，尤其40 μmol/L組圓形細(xì)胞明顯變少，神經(jīng)突起狀細(xì)胞增多，與對(duì)照組細(xì)胞相比，無(wú)明顯的細(xì)胞形態(tài)改變。GSH是一種抗氧化劑，聯(lián)合作用后細(xì)胞受損情況減弱，貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)到與對(duì)照組相似的形態(tài)，說(shuō)明GSH可能通過(guò)抗氧化抑制姜黃素引起的氧化損傷，使細(xì)胞向正常生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)。

圖2 CCK-8法檢測(cè)姜黃素作用下U87細(xì)胞的增殖率

2.2 姜黃素處理使U87細(xì)胞ROS升高

ROS是細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的包括超氧陰離子自由基等含氧的不穩(wěn)定離子或小分子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞顯示，姜黃素作用后細(xì)胞內(nèi)ROS升高。對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)DCF熒光發(fā)光微弱(圖4：A)表明細(xì)胞內(nèi)ROS含量較低。5、10 μmol/L姜黃素處理U87細(xì)胞3 h后胞內(nèi)熒光依次增強(qiáng)(圖4：B和C)表明ROS含量依次增高。而GSH的加入清除了胞內(nèi)部分ROS(圖4：E和F)。

熒光染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧結(jié)果也顯示姜黃素促進(jìn)ROS升高。以對(duì)照組熒光強(qiáng)度為1時(shí)處理組相對(duì)強(qiáng)度見(jiàn)圖5，U87細(xì)胞經(jīng)姜黃素(5和10 μmol/L)處理3、6 h后，ROS含量顯著上升，且10 μmol/L姜黃素處理組上升水平更顯著，是未處理細(xì)胞的2倍多。說(shuō)明在6 h內(nèi)姜黃素以時(shí)間-劑量依賴的方式使U87細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。在加入抗氧化劑GSH預(yù)處理1 h組，5和10 μmol/L姜黃素組的ROS水平較姜黃素單獨(dú)處理均明顯降低。說(shuō)明姜黃素可以引起ROS含量的顯著升高，而且抗氧化劑GSH減弱了這種作用。

圖3 姜黃素與GSH對(duì)U87細(xì)胞形態(tài)的影響(200×)

圖4 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)姜黃素和GSH作用于U87細(xì)胞ROS的變化

2.3 姜黃素誘導(dǎo)U87細(xì)胞NADPH氧化酶活性增高

細(xì)胞中除了線粒體呼吸鏈，NADPH-OX是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源。當(dāng)以5～40 μmol/L姜黃素作用于U87細(xì)胞后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NADPH-OX活性逐漸升高(圖6)，10 μmol/L就顯示顯著差異。NADPH-OX抑制GKT137831的加入，使酶活性差異顯著下降。

2.4 姜黃素處理后U87細(xì)胞處于氧化脅迫

當(dāng)細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)難以抵御ROS的氧化作用，氧化脅迫(oxidative stress)就會(huì)威脅到細(xì)胞的正常代謝。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量反應(yīng)了細(xì)胞膜受ROS氧化損傷的程度。姜黃素處理后細(xì)胞MDA含量隨姜黃素濃度升高而增加(圖7：A)，說(shuō)明5～40 μmol/L濃度的姜黃素引起細(xì)胞膜濃度依賴性氧化損傷，且自10 μmol/L起MDA即顯著、40 μmol/L時(shí)已極顯著升高。還原型GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化因子，具有清除內(nèi)源性或外源性活性氧代謝產(chǎn)物的作用。姜黃素作用后，GSH含量急劇下降(圖7：B)，40 μmol/L姜黃素使得GSH下降為原來(lái)的十分之一，表明姜黃素的作用使得細(xì)胞中氧化作用消耗了大量還原力。

T-AOC是包括酶和非酶系統(tǒng)在內(nèi)的全部抗氧化物的總抗氧化能力的指標(biāo)。姜黃素處理使細(xì)胞T-AOC顯著并呈濃度依賴性降低(圖7：C)。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以清除超氧陰離子等超氧化物，對(duì)抗與阻斷對(duì)細(xì)胞造成的損害。如圖(7：D)所示，濃度較低(5 μmol/L)時(shí)，姜黃素處理降低了細(xì)胞SOD，表明氧化脅迫消耗了一部分酶，而濃度升高至10、20 μmol/L時(shí)酶活性升高，而40 μmol/L姜黃素處理SOD含量又降低。這可能是由于姜黃素引起的促氧化誘導(dǎo)了SOD的產(chǎn)生，高濃度的姜黃素促氧化作用過(guò)強(qiáng)，損傷并降低了細(xì)胞SOD活性。

圖5 姜黃素單獨(dú)及與GSH連用后3和6 h后的活性氧水平

圖6 姜黃素作用下U87細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活力升高

2.5 姜黃素誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡

熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是，吖啶橙(acridine orange，AO)能通過(guò)細(xì)胞膜并嵌入細(xì)胞核DNA，發(fā)出明亮的綠色熒光；嗅化乙錠(ethidium bro mide，EB)只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞DNA并發(fā)出橙色熒光。熒光顯微鏡下可見(jiàn)活細(xì)胞核染色質(zhì)呈均一綠色，早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈綠色凝聚或圓珠狀。晚期凋亡細(xì)胞呈橙色、固體或圓珠狀。非凋亡壞死細(xì)胞核染色質(zhì)呈橙色。

圖7 姜黃素作用下U87細(xì)胞丙二醛水平、谷胱甘肽含量、總抗氧化能力及超氧化物歧化酶活力

姜黃素處理U87細(xì)胞24 h后，AO/EB染色的結(jié)果如圖8所示，對(duì)照組細(xì)胞核完整，顯示為綠色熒光均一的正常形態(tài)(圖8：A)；5 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝集，類似早期凋亡(圖8：B)；10 μmol/L姜黃素引起細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色和橘紅色染色質(zhì)，表明出現(xiàn)了晚期凋亡(圖8：C)。濃度至40 μmol/L時(shí)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量的紅色染色質(zhì)和部分黃色染色質(zhì)，且核染色質(zhì)呈固縮狀，表明出現(xiàn)了細(xì)胞晚期凋亡和壞死(圖8：D)。當(dāng)姜黃素與5 mmol/L GSH聯(lián)合處理后，呈黃色和紅色的核染色質(zhì)的細(xì)胞減少，綠色均一熒光細(xì)胞回升(圖8：E，F(xiàn))?？梢?jiàn)5～40 μmol/L姜黃素可使U87細(xì)胞凋亡，抗氧化劑GSH能減弱姜黃素誘導(dǎo)的U87細(xì)胞核損傷及凋亡。

圖8 AO/EB法檢測(cè)姜黃素誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡

Annexin V/PI雙染后以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可量化凋亡細(xì)胞。在細(xì)胞凋亡的早期階段，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)會(huì)外翻到細(xì)胞膜的外側(cè)，Annexin V可以選擇性結(jié)合PS。碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一種DNA結(jié)合染料，可在細(xì)胞凋亡后期對(duì)壞死細(xì)胞或失去細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析可以檢測(cè)細(xì)胞的狀態(tài)。

Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞結(jié)果如圖9所示，姜黃素處理組細(xì)胞凋亡率上升，呈現(xiàn)濃度依賴性，姜黃素濃度越高，U87細(xì)胞凋亡率越高。5、10、20、40 μmol/L處理后細(xì)胞總凋亡率從3.87%升高至98.70%。在10、40 μmol/L 姜黃素組加入抗氧化劑GSH聯(lián)合處理后，細(xì)胞總凋亡率分別從7.33%和98.70%下降到6.65%和70.85%，明顯減弱了姜黃素誘導(dǎo)的凋亡作用，進(jìn)一步說(shuō)明姜黃素通過(guò)促氧化誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡。

2.6 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路蛋白

通過(guò)Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白信號(hào)通路(圖10)發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理使NF-κB/p65蛋白的表達(dá)水平明顯下降，與5 mmol/L GSH共同處理后蛋白表達(dá)水平上升，表明姜黃素引起的ROS升高可以下調(diào)NF-κB/p65蛋白的表達(dá)；檢測(cè)線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，即升高Bax/Bcl-2值；并發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是Caspase依賴的。檢測(cè)結(jié)果顯示姜黃素下調(diào)了Pro Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明相對(duì)增加了其激活形式的Caspase-3的量，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。加入抗氧化劑GSH檢測(cè)這些蛋白顯示，GSH均逆轉(zhuǎn)了姜黃素的作用，也說(shuō)明姜黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是通過(guò)促氧化作用實(shí)現(xiàn)的。

綜合以上各項(xiàng)研究結(jié)果表明，姜黃素在作用于人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后，通過(guò)提高細(xì)胞NADPH氧化酶活性而促進(jìn)ROS產(chǎn)生，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)改變，包括T-AOC降低、MDA升高、GSH下降、SOD升高，即姜黃素處理使得U87細(xì)胞處于氧化脅迫，且隨著濃度升高脅迫加重。ROS的升高，觸發(fā)了細(xì)胞信號(hào)通路，下調(diào)NF-κB/p65蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中Bax和Bcl-2的差異性表達(dá)，最終通過(guò)凋亡執(zhí)行分子Caspase-3使細(xì)胞凋亡。

圖9 YF488-Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)姜黃素與GSH誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡

圖10 姜黃素對(duì)NF-κB、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

姜黃素是一種天然膳食多酚類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和促進(jìn)傷口愈合等多種藥理活性。其中抗癌活性備受關(guān)注，少量動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)也證明了姜黃素的抗癌作用。包括多名患者的65個(gè)臨床試驗(yàn)也證明，姜黃素對(duì)人類健康有廣泛的有益影響[6]。構(gòu)效關(guān)系研究揭示一些苯環(huán)上甲氧基的存在提高了姜黃素的活性[7]。研究表明，姜黃素是通過(guò)抗氧化抑制多種類型癌細(xì)胞生長(zhǎng)，包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、胰腺癌和結(jié)腸癌，但對(duì)人腦膠質(zhì)瘤的研究甚少。

正常情況下ROS作為活性因子參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。一些體內(nèi)外因素會(huì)引起ROS升高，若細(xì)胞氧化-還原失去平衡產(chǎn)生氧化脅迫，ROS就會(huì)通過(guò)損傷DNA導(dǎo)致突變而作為癌發(fā)生的觸發(fā)劑。但與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞有更高含量的ROS為人們提供了通過(guò)加強(qiáng)氧化脅迫殺死癌細(xì)胞的思路。一些抗癌藥物如紫杉醇可通過(guò)產(chǎn)生ROS損傷癌細(xì)胞或通過(guò)ROS干擾癌細(xì)胞代謝。甚至有些抗癌試劑如蓽茇明堿(piperlongumine)只結(jié)合于癌細(xì)胞的幾個(gè)抗氧化酶如GST和羰基氧化酶的活性位點(diǎn)[8]。很多文獻(xiàn)報(bào)道了姜黃素的促氧化作用，有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過(guò)提高細(xì)胞ROS及相關(guān)細(xì)胞凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。這些似乎與姜黃素的抗氧化作用相矛盾，究其原因，是該化合物作用時(shí)的濃度和處理細(xì)胞的種類決定的，低濃度時(shí)具有抗氧化作用。如用脂多糖處理小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)，氧化指標(biāo)一氧化氮和其合成酶等都升高，而抗氧化酶SOD活性降低。在較低濃度(10～20 μmol/L)的姜黃素作用下，一氧化氮和合成酶等都明顯降低，SOD活性明顯上升，表明姜黃素在此濃度下具抗氧化性[10]，與本文中姜黃素在10～20 μmol/L時(shí)對(duì)U87細(xì)胞SOD活力提升一致。當(dāng)用姜黃素處理食管癌 KYSE410時(shí)，該細(xì)胞的MDA含量升高，SOD水平降低，較高濃度(40 μmol/L)引起的氧化脅迫更嚴(yán)重[11]。此外，不同種類細(xì)胞效果也不盡相同[12]。本文用姜黃素處理U87細(xì)胞，顯示姜黃素抑制U87細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性氧水平升高、氧化脅迫增加進(jìn)而引起細(xì)胞信號(hào)蛋白變化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果將為姜黃素的臨床應(yīng)用提供重要數(shù)據(jù)和理論參考。