紅曲霉的初篩及在黃酒釀造中的應(yīng)用

夏培禹，袁 寧，管桂坤，萬自然，劉 宇，王 濤

（山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731）

紅曲霉（Monascus）是一種絲狀腐生真菌，在生長(zhǎng)代謝過程中可利用各種碳源及氮源生成次級(jí)代謝產(chǎn)物紅曲色素，而紅曲色素作為一種天然的可食用色素，在我國(guó)傳統(tǒng)的食用和藥用市場(chǎng)具有很好的應(yīng)用前景。王柏琴等[1]利用紅曲色素對(duì)pH值穩(wěn)定、耐熱、耐光及不易被氧化還原等特性，在香腸制作中將其取代對(duì)人體有害的亞硝酸鈉用于發(fā)色，成色效果良好且穩(wěn)定；Lee 等[2]已證明紅曲色素中的黃色素具有降血壓的作用，同時(shí)Su[3]發(fā)現(xiàn)紅曲色素具有抗腫瘤、抗癌的作用。

紅曲黃酒是最具有特色的黃酒之一，紅曲作為糖化劑加入黃酒的發(fā)酵中，可使酒液呈現(xiàn)特殊的色澤，酒味醇厚香濃，口感淡雅、爽口宜人，主要品牌有福建老酒、沉缸酒及義烏丹溪紅曲酒等[4]。紅曲霉在黃酒的釀造中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可分泌到酒中，除含有鈣、磷、鐵等元素，還含有硒、錳、銅、鋅等微量元素，且黃敏欣等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃酒的發(fā)酵中添加紅曲，可使γ-氨基丁酸的含量增加2.16 倍，可較好的提高黃酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)紅曲霉在發(fā)酵中產(chǎn)生的活性物質(zhì)還具有阻礙膽固醇合成，降血脂，預(yù)防多種心腦血管疾病，提高免疫力、美容養(yǎng)顏等[6-7]功效。本文將從中溫大曲中初篩的紅曲霉，應(yīng)用到黃酒的釀造中，探究其對(duì)黃酒風(fēng)味口感的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：中溫大曲，山東蘭陵美酒股份有限公司；黃酒專用活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；黍米，朝陽(yáng)益充雜糧有限公司。

儀器設(shè)備：YXQ-LS-75SN 立式壓力蒸汽滅菌鍋；JHT-系列凈化工作臺(tái)；A-1502 分光光度計(jì)，上海譜元；MJX-280S 智能霉菌培養(yǎng)箱；FLY-211C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱；安捷倫7890A氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選

將含有粉紅色菌落的中溫大曲曲心粉碎，分別加入無菌水中振蕩搖勻，于60 ℃水浴中恒溫30 min以殺死不耐熱的細(xì)菌及酵母，吸取懸液用無菌水將其稀釋成10-1～10-7的不同梯度，然后各吸取200 μL 的菌懸液涂布于麥芽汁固體培養(yǎng)基上，每梯度做兩個(gè)平行。30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，挑取紅色菌落，進(jìn)行平板劃線純化培養(yǎng)。然后根據(jù)菌落特征、顏色及所產(chǎn)香味等指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，獲得純種單菌落。純菌接入麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上備用[8]。

1.2.2 紅曲米的制備

取斜面培養(yǎng)的紅曲霉，接入滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于搖床150 r/min，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，然后將活化后的菌種培養(yǎng)液分別進(jìn)行無菌過濾計(jì)數(shù)，將其濃度調(diào)整至2×106個(gè)/L，備用[9-10]。

500 mL 錐形瓶中裝入50 g 大米，加水過夜浸泡，然后將其瀝干，于滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，冷卻后將其搖散，分別加入5 mL 調(diào)整好的2×106個(gè)/L 菌液，每組3 個(gè)平行，混勻后，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 左右，米粒表面發(fā)白長(zhǎng)滿菌絲，之后每天進(jìn)行兩次搖瓶，使米粒分散，約10 d 米粒表面完全紅透，烘干，獲得紅曲米成品[11]。

1.2.3 紅曲糖化力測(cè)定

糖化力的測(cè)定參照GB 1886.174—2016[12]。

1.2.4 紅曲酯化酶活力的測(cè)定[13]

測(cè)定方法為：3 mL 反應(yīng)體系：乙酸對(duì)硝基苯酯240 μL（4.5 μg/μL）、粗酶液300 μL 和乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH6）2460 μL。混勻后測(cè)量OD405nm值并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h 后終止反應(yīng)，再測(cè)定1 次OD405nm，根據(jù)所得OD 值計(jì)算反應(yīng)體系中的酶活（酶活力單位定義：在一定條件下每1 min 釋放出1 μmol 對(duì)硝基苯酚所消耗的酯化酶的酶量定義為一個(gè)脂肪酶活力單位（U）。

1.2.5 紅曲中紅曲色素的測(cè)定[7]

紅曲色素提取及測(cè)定方法參照GB 1886.19—2015。將粉粹混勻的0.2 g 試樣，用70%乙醇溶液溶解并將其轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容，60 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，用70%乙醇溶液定容，混勻后過濾，50 mL 的容量瓶中加入適量濾液，70%乙醇溶液定容，混勻后，在505 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定處理后樣品中的吸光值A(chǔ)，并以下公式計(jì)算樣品色階：

X1=A×100/m1×50/V

式中：X1 為色階（U/g）；A 為樣品吸光值；m1 為樣品質(zhì)量（g）；V為吸取乙醇浸泡液的體積（mL）。

1.2.6 發(fā)酵操作

將浸泡20 h 以上的黍米蒸熟，黍米與水以1:2的比例加入錐形瓶中，待冷至常溫，紅曲米的添加量均為原料的10%，酵母添加量為原料的1‰，混勻，放入恒溫培養(yǎng)箱30 ℃發(fā)酵，6 d 后測(cè)其酒度、總酸等指標(biāo)。

1.2.7 黃酒風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

采用安捷倫7890A氣相色譜儀檢測(cè)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉菌株的篩選

通過分離、純化和形態(tài)的初步鑒定，共獲取3株紅曲霉，分別命名為Q1、Q2及Q3，然后分別加入25%甘油中，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 紅曲米的理化性質(zhì)（表1）

表1 紅曲米的理化性質(zhì)

將3 株篩選出的紅曲霉分別以大米培養(yǎng)，所得紅曲米的糖化力及紅曲色素如表1 所示，中溫大曲中篩選出的紅曲霉Q3 的糖化力及紅曲色素含量均明顯高于另外兩株紅曲霉，且培養(yǎng)的紅曲米符合GB 1886.19—2015 中對(duì)食品添加劑紅曲米（粉）產(chǎn)品色階≥1000 U/g 的要求。而酯化酶活力中，紅曲霉Q1的活力則最高。

2.3 紅曲釀造黃酒的理化指標(biāo)（表2）

表2 黃酒的理化指標(biāo)

由表2 可知，3 株篩選出的紅曲霉培養(yǎng)的紅曲米在黃酒發(fā)酵中的理化指標(biāo)，其中總酸的含量相差不大，說明3 株紅曲霉對(duì)黃酒釀造中總酸的產(chǎn)生量影響不大，而酒度及還原糖的含量則有明顯的差異，紅曲霉Q3 所產(chǎn)酒精含量最高，且剩余總糖的含量最低，說明該組黃酒發(fā)酵中的酒精轉(zhuǎn)化率較高，而酒精轉(zhuǎn)化率較高的原因可能與紅曲霉Q3 的糖化力較高有關(guān)，可將原料較充分的糖化，以供酵母產(chǎn)生更多的酒精。而紅曲霉Q2 的糖化力比Q1 高，酒精的產(chǎn)生量卻比Q1 少，剩余總糖的含量也較高，推測(cè)可能是生成酒精的酵母在黃酒釀造中受到紅曲霉Q2 的抑制，而紅曲霉Q3 與Q1 對(duì)酵母生成酒精的影響不大，進(jìn)而成為導(dǎo)致其酒精生成量相對(duì)少的原因。

2.4 紅曲釀造黃酒中的高級(jí)醇含量（表3）

表3 黃酒中的高級(jí)醇含量 (mg/L)

適宜的高級(jí)醇含量能賦予黃酒以柔和、醇厚、圓潤(rùn)、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺，而高級(jí)醇在體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，因此會(huì)停留較長(zhǎng)時(shí)間，當(dāng)黃酒中含有過量的高級(jí)醇，消費(fèi)者飲用黃酒易“上頭”，易醉，同時(shí)會(huì)引起腦部損傷及認(rèn)知障礙[15]。由表3可以看出，3 株篩選出的紅曲霉在黃酒發(fā)酵中產(chǎn)生的高級(jí)醇含量存在差異性，紅曲霉Q3 在黃酒發(fā)酵中所產(chǎn)生的總高級(jí)醇含量明顯低于另外篩選出的兩株紅曲霉，推測(cè)可能是紅曲霉Q3 在黃酒發(fā)酵中會(huì)影響高級(jí)醇的生成途徑，或會(huì)以消耗高級(jí)醇為碳源促進(jìn)自身的生長(zhǎng)增殖，進(jìn)而導(dǎo)致高級(jí)醇的生成量相對(duì)減少。

2.5 黃酒中乙酸及兩種相關(guān)酯的含量

酯類物質(zhì)是黃酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)黃酒的風(fēng)味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，通常具有很強(qiáng)的水果味或花香味[16]。黃酒中酯的種類多但產(chǎn)生量較少，故將含量較高且差異變化較明顯的兩種酯由表4 列出，可以看出，紅曲霉Q3 在黃酒釀造中不論是乙酸乙酯還是乳酸乙酯的產(chǎn)生量均高于另外兩株紅曲霉，且乙酸乙酯的產(chǎn)生量均高于其他兩株紅曲霉的2 倍。雖然紅曲霉Q3 的酯化酶活力在3 株菌中不是最高，但在黃酒釀造中，乙酸乙酯及乳酸乙酯的產(chǎn)生量卻是最高的，從乙酸的含量推測(cè)可能是紅曲霉Q3 在黃酒釀造中會(huì)促進(jìn)乙酸菌等微生物產(chǎn)生較多的乙酸，同時(shí)促進(jìn)乳酸菌等微生物產(chǎn)生較多的乳酸，進(jìn)而使得具有酯化能力的紅曲霉Q3 將其分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯類物質(zhì)。雖然紅曲霉Q1 的酯化能力最高，但兩種酯的含量卻較低，可能由于在黃酒釀造中紅曲霉Q1 對(duì)各類酯相應(yīng)的有機(jī)酸類物質(zhì)產(chǎn)生量較少，從而導(dǎo)致后期酯的產(chǎn)生量相對(duì)較少。

表4 黃酒中乙酸及兩種相關(guān)酯的產(chǎn)生量(mg/L)

3 總結(jié)

中溫大曲中篩選出的紅曲霉Q3 培養(yǎng)的紅曲米，不論在糖化力還是產(chǎn)紅曲色素的能力方面都要優(yōu)于另外兩株紅曲霉Q1 及Q2。3 株紅曲霉在黃酒釀造中，在對(duì)總酸的產(chǎn)生量無明顯影響的情況下，

紅曲霉Q3 發(fā)酵后的剩余總糖量最低，酒精產(chǎn)量最高，說明其在發(fā)酵過程中能更好的利用原料，提高酒精含量，同時(shí)也可在發(fā)酵中通過抑制高級(jí)醇的生成途徑或以其為碳源滿足自身生長(zhǎng)增殖，從而使得產(chǎn)生的高級(jí)醇含量要低于其他兩株紅曲霉。乙酸乙酯及乳酸乙酯作為黃酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，在黃酒的風(fēng)格方面影響很大。3 株紅曲霉中紅曲霉Q1的酯化酶活力最高，但在黃酒發(fā)酵中產(chǎn)生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量卻不是最高。而紅曲霉Q3 產(chǎn)生的乙酸乙酯及乳酸乙酯的含量最高，說明紅曲霉Q3 能夠提高黃酒液態(tài)發(fā)酵中的酯化能力。而從紅曲霉Q3 產(chǎn)生較高的乙酸含量推測(cè)，可能是紅曲霉Q3 會(huì)促進(jìn)乙酸菌等微生物產(chǎn)生乙酸，亦可促進(jìn)乳酸菌等微生物產(chǎn)生乳酸，使得乙酸乙酯及乳酸乙酯的前體物質(zhì)產(chǎn)生量較多，進(jìn)而導(dǎo)致其相應(yīng)酯的含量增高。因此，黃酒釀造中的中溫大曲中初篩選出的紅曲霉Q3 在提高原料利用率，提高酒精含量，改進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)格等方面有很好的應(yīng)用前景。