高效液相色譜法測(cè)定注射用左亞葉酸鈉的有關(guān)物質(zhì)

朱麗娟

摘? ?要：為了研究注射用左亞葉酸鈉中的相關(guān)物質(zhì)，文章使用色譜檢驗(yàn)法，檢測(cè)出左亞葉酸鈉的定量限為2.0 ng，檢測(cè)限為0.6 ng?？梢姡咝б合嗌V法可用于測(cè)定注射用左亞葉酸鈉的有關(guān)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：左亞葉酸鈉;高效液相色譜法;有關(guān)物質(zhì)

色譜檢測(cè)法指的是將不同的細(xì)菌混合物在特定的環(huán)境中進(jìn)行相互溶解、解析、吸附、脫附，在以上的環(huán)境中進(jìn)行多次的操作之后能夠得到物質(zhì)的分離現(xiàn)象，并且隨之使用不同的檢測(cè)形式進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)部的檢驗(yàn)，能夠?qū)⒓?xì)菌甄別到屬、種甚至株，能夠保證較高的分辨率和較為準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果，并且分析的速度較快，能夠在檢驗(yàn)的過程中分析出較為穩(wěn)定的指標(biāo)。在分析中不會(huì)受到細(xì)菌年齡、生長(zhǎng)條件等客觀因素的影響，對(duì)于細(xì)菌的鑒別具有十分重要的作用。

1? ? 實(shí)驗(yàn)方法

材料準(zhǔn)備需要注射用左亞葉酸鈉放置于飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

1.1? 專屬性實(shí)驗(yàn)

（1）96孔板接種細(xì)胞：PC-3和RWPE-1，HCT-116接種質(zhì)量濃度為5 000個(gè)/孔、2 000個(gè)/孔。每9個(gè)實(shí)驗(yàn)組為96孔板，每一個(gè)孔板上有6個(gè)復(fù)孔。其中，培養(yǎng)要求是0.25%胰酶-EDTA能夠在常規(guī)環(huán)境中完全消化，并且成為單個(gè)細(xì)胞懸液。培養(yǎng)的要求為在CO2的飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

刺激細(xì)胞：對(duì)于左亞葉酸鈉干預(yù)細(xì)胞的刺激強(qiáng)度為0～8.4 mmol/L依次遞增的情況，進(jìn)而能夠看出不同刺激強(qiáng)度的背景下，干預(yù)細(xì)胞自身出現(xiàn)的情況和變化，保證實(shí)驗(yàn)效果的科學(xué)性和真實(shí)性。培養(yǎng)的要求為在CO2的飽和濕度敷箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

（3）呈色：在上述步驟進(jìn)行之后，在培養(yǎng)容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔劑量），并且保證培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和正常，此次的培養(yǎng)時(shí)間為3 h左右。在此基礎(chǔ)上，將上清液吸走，并且在培養(yǎng)孔中添加150 μL DMSO。值得注意的是，添加此類試劑之后，液體中極易出現(xiàn)沉淀物，需要將試管輕輕晃動(dòng)，保證添加劑能夠充分溶解。

1.2? 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)—SDS-PAGE凝膠電泳

灌分離膠：TEMED加入的計(jì)量與分子量的不同配置不同濃度之間具有密切的關(guān)系。在灌膠的過程中應(yīng)當(dāng)保證灌膠的速度，在灌膠高度在容器總高度的1/3左右，即5.5 cm左右的情況下就代表灌膠結(jié)束。此時(shí)，可以使用雙蒸水緩慢封閉容器。由于這一系列的操作關(guān)系著實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，在進(jìn)行操作的過程中應(yīng)當(dāng)采用輕柔緩慢的操作手法，避免對(duì)人工環(huán)節(jié)造成影響。在整體的操作結(jié)束之后，將實(shí)驗(yàn)設(shè)備靜置30 min左右，隨后觀察情況。

灌濃縮膠：30 min自由凝固結(jié)束之后，觀察到容器中水和膠水之間中存在一條明顯的折線就能夠證明膠水已經(jīng)凝固。當(dāng)膠水凝固之后則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)工作，添加一部分水在容器上方，多余的水分需要使用紙巾擦拭干凈。與此同時(shí)，將配置好的試劑快速加入其中，在添加之后保證設(shè)備能夠平穩(wěn)靜置，保證靜置時(shí)間在30 min以上。24 h之后，將膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋。非磷酸化二抗稀釋液：3%的牛奶稀釋。將膜放入加了二抗的二抗稀釋液中，室溫慢搖3 h。孵育完畢后用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。

1.3? 含量測(cè)定

1.3.1? 細(xì)胞準(zhǔn)備

對(duì)于PC-3細(xì)胞，0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行常規(guī)消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接種濃度為5 000個(gè)/孔、2 000個(gè)/孔。每9個(gè)實(shí)驗(yàn)組為96孔板，每一個(gè)孔板上有6個(gè)復(fù)孔。在相同的環(huán)境背景下，4.8 mmol/L，7.2 mmol/L的左亞葉酸鈉對(duì)于p-mTOR的表達(dá)都具有明顯的影響作用，并且應(yīng)用在p-p70S6k，p-S6，p-4E和p-4E-BP1的表達(dá)的影響上效果相同。

1.3.2? 蛋白樣品的制備

（1）保證培養(yǎng)時(shí)間超過24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，沖洗使用的試劑是4 ℃預(yù)冷的PBS。每瓶細(xì)胞將PBS盡量吸取干凈，而后加入200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液槍緩慢將細(xì)胞碎片吹打至瓶底一角（稱為裂解蛋白液），在裂解蛋白液的過程中應(yīng)當(dāng)保證不要有氣泡。將裂解之后的試劑放在冰上靜置10 min左右，與此同時(shí)將離心機(jī)進(jìn)行4 ℃預(yù)冷。

（3）將裂解蛋白液移至EP管內(nèi)，12 000 r，30 min，同時(shí)打開紫外分光光度儀進(jìn)行初始化。

（4）取3×10 μL共3管，用不含蛋白酶抑制劑的RIPA洗3次，在上述步驟進(jìn)行之后，在培養(yǎng)容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔劑量），并且保證培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定和正常，此次的培養(yǎng)時(shí)間為3 h左右。在此基礎(chǔ)上，將上清液吸走，并且在培養(yǎng)孔中添加150 μL DMSO。需要將培養(yǎng)皿放在搖床上輕輕搖動(dòng)，保證其中的試劑能夠充分溶解。

2? ? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜檢驗(yàn)在實(shí)行的過程中具有極強(qiáng)的敏感性和特異性，在進(jìn)行病原體和微生物檢驗(yàn)檢測(cè)的過程中，能夠呈現(xiàn)出自身的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于微生物的檢驗(yàn)過程中對(duì)于微生物樣本的質(zhì)量要求較低，即便是檢測(cè)樣本中存在大量死亡微生物，也能夠保證檢驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性。一旦檢測(cè)樣本中有兩種或者是兩種以上的微生物，傳統(tǒng)意義上的檢驗(yàn)進(jìn)程需要進(jìn)行微生物的提純，進(jìn)而保證檢驗(yàn)的真實(shí)性，而色譜檢驗(yàn)則可以在樣本成分復(fù)雜的情況下進(jìn)行檢驗(yàn)，并且提供準(zhǔn)確的檢驗(yàn)效果。本品分別在酸、堿、氧化、光照、高濕及高溫條件中進(jìn)行強(qiáng)制破壞，各降解產(chǎn)物均能檢出，且與主成分峰能達(dá)到良好分離。

3? ? 結(jié)語

左亞葉酸鈉在世界范圍內(nèi)的臨床診療中具有廣泛并且良好的使用效果，由于在治療的過程中副作用較小，成為醫(yī)生們高頻使用的藥物。近年來，左亞葉酸鈉逐漸被發(fā)現(xiàn)在治療腫瘤的治療中具有良好的效果，但是其中存在的安全隱患和局限性仍舊未能得到良好的整合和研究。在診療過程中使用抗雄激素療法能夠取得相應(yīng)的治療成效，然而患者在接受診療的過程中經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)激素治療的抵抗現(xiàn)象，進(jìn)而影響了前列腺治療的穩(wěn)定性和有效性。長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)于治療前列腺的方式方法均沒有穩(wěn)定的界定和實(shí)施，逐漸成為前列腺疾病治療的關(guān)鍵性難題。

[參考文獻(xiàn)]

[1]楊成.高效液相色譜法測(cè)定注射用左亞葉酸鈉的有關(guān)物質(zhì)[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2019（21）：185-186，188.

[2]周平凡，王東凱.pH對(duì)左亞葉酸鈉注射液穩(wěn)定性的影響[J].中國(guó)新藥雜志，2017（24）：2995-2998.