鴿源綠膿桿菌的分離鑒定及致病性試驗(yàn)

李珮瑤 高晶萍 田勇 徐明舉 利凱 李軍 張瑞華 徐彤

摘要：從疑似賽鴿綠膿桿菌感染病料中分離綠膿桿菌并進(jìn)行相關(guān)致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，為今后賽鴿綠膿桿菌防治提供參考。采用常規(guī)方法從肝臟、肺臟等組織中無(wú)菌釣取細(xì)菌于普通瓊脂、麥康凱、鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基中，隨后進(jìn)行染色鏡檢、生化試驗(yàn)鑒定;對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性研究，將10只未經(jīng)免疫的30～40日齡的雛鴿隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組進(jìn)行感染，10只BALB/c小鼠同樣隨機(jī)分組進(jìn)行感染，觀察并記錄感染動(dòng)物臨床癥狀及死亡率;通過(guò)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)該菌對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明等10余種藥的敏感性。結(jié)果表明，分離得到的菌株根據(jù)培養(yǎng)及菌落特征、生化試驗(yàn)確定為綠膿桿菌;人工感染小鼠發(fā)病率為100%，死亡率為60%;試驗(yàn)組鴿子發(fā)病率為60%，無(wú)死亡;該菌對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、妥布霉素和環(huán)丙沙星高度敏感。

關(guān)鍵詞：賽鴿;綠膿桿菌;細(xì)菌分離鑒定;致病性;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0189-03

收稿日期：2019-03-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31672522）;國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號(hào)：31602030）;河北省第二期現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋肉雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：HBCT2018150207）;河北省教育廳在讀研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)資助項(xiàng)目（編號(hào)：CXZZSS2018129）;賽鴿主要疫病防控技術(shù)體系研究（自籌經(jīng)費(fèi)）。

作者簡(jiǎn)介：李珮瑤（1996—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：peiyaoli19@163.com。

通信作者：徐?彤，教授，主要從事動(dòng)物流感病毒誘導(dǎo)肺損傷機(jī)理研究。E-mail：xutong1969@sohu.com。

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）1882年由Gessard從傷口膿液中首次分離報(bào)道[1]。該菌在自然界中分布十分廣泛，是臨床常見(jiàn)的條件致病菌之一。臨床中常因注射污染、疲勞運(yùn)輸、驚嚇等應(yīng)激因素導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降，引起該病發(fā)生。綠膿桿菌可引起多種家畜、家禽、野生動(dòng)物發(fā)病，尤其可引起雛雞和貂的出血性肺炎、奶牛的子宮炎和乳房炎等，同時(shí)也可感染人類[2]。隨著集約化的快速發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，該菌在感染過(guò)程中的角色也由之前的繼發(fā)或混合感染逐漸演變?yōu)樵l(fā)或并發(fā)[3]，這使得該病死亡率愈來(lái)愈高。近年，雛雞、山羊、水貂、獺兔、狐貍、小熊貓及鴕鳥等均有感染綠膿桿菌的報(bào)道[4-10]，可見(jiàn)綠膿桿菌對(duì)不同種類的動(dòng)物均有易感性，但臨床表現(xiàn)及剖檢癥狀有差異。

近年來(lái)，賽鴿成為一項(xiàng)重要的競(jìng)技運(yùn)動(dòng)，隨著人們的關(guān)注度越來(lái)越高，賽鴿運(yùn)動(dòng)飛速發(fā)展。然而，在“集鴿”這一特殊飼養(yǎng)模式下，不同免疫水平的鴿子經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸后集中于同一棚內(nèi)，因此臨床中鴿綠膿桿菌一般是新城疫、鴿痘等疾病的繼發(fā)菌[11]，導(dǎo)致賽鴿大量死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。但由于人們之前對(duì)其重視程度不夠，在臨床中沒(méi)有良好的治療方案。筆者通過(guò)對(duì)臨床病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定并做相關(guān)致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，為臨床中綠膿桿菌的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?病料及試驗(yàn)動(dòng)物

疑似鴿綠膿桿菌的病料，由天津某賽鴿公棚提供;6～8周齡、SPF級(jí)BALB/c小鼠，購(gòu)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;30～40日齡、未經(jīng)任何免疫試驗(yàn)的雛鴿10羽，購(gòu)于河北省張家口市某肉鴿養(yǎng)殖戶。

1.2?試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蘇木精、伊紅，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化學(xué)研究所有限公司;藥敏片，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3?主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈臺(tái)，購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;顯微鏡，購(gòu)自O(shè)lympus。

1.4?背景調(diào)查

病鴿主要表現(xiàn)吃食減少，精神不振;不同程度下痢，糞便水樣，呈淡黃綠色，嚴(yán)重的糞中帶血;腹部膨大，手壓柔軟，后期呈腹式呼吸;有的眼周圍發(fā)生不同程度水腫，水腫部破裂流出液體，形成痂皮，眼全閉或半閉，流淚;頸部皮下水腫，嚴(yán)重的兩腿內(nèi)側(cè)部皮下也見(jiàn)水腫。

1.5?細(xì)菌分離

從病死鴿的肝臟、脾臟、肺臟等無(wú)菌操作釣菌分別劃線接種于普通瓊脂、鮮血瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基顏色及菌落形態(tài)，挑取有代表性的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.6?細(xì)菌鑒定

1.6.1?涂片染色鏡檢

將純化培養(yǎng)的細(xì)菌典型菌落釣菌進(jìn)行涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，于油鏡下觀察菌落的形態(tài)及染色特征。

1.6.2?生化鑒定

將純化后的細(xì)菌分別接種于葡萄糖、乳糖、苯丙氨酸、甲基紅、三糖鐵等生化管中，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，觀察并記錄生化結(jié)果。

1.7?致病性試驗(yàn)

1.7.1?BALB/c小鼠致病性試驗(yàn)

采用上述細(xì)菌接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，將10只SPF BALB/c小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各5只，感染組每只腹腔注射0.1 mL該細(xì)菌，對(duì)照組相同途徑注射 0.1 mL 生理鹽水，飼養(yǎng)于環(huán)境相同的獨(dú)立通風(fēng)籠內(nèi)，觀察并記錄其臨床表現(xiàn)、發(fā)病率及死亡率。取死亡小鼠的肝臟進(jìn)行釣菌、染色，以驗(yàn)證致病菌與接種菌是否一致。

1.7.2?鴿子致病性試驗(yàn)

取10羽未經(jīng)免疫、30～40日齡的雛鴿，隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組5羽，感染組每羽肌肉注射0.2 mL細(xì)菌鮮血瓊脂培養(yǎng)物，對(duì)照組肌肉注射0.2 mL生理鹽水，觀察記錄其臨床癥狀、發(fā)病率和死亡率。

1.8?藥敏試驗(yàn)

參照Kirby-Barer氏法，將純培養(yǎng)的綠膿桿菌鮮血瓊脂培養(yǎng)物均勻涂抹至普通瓊脂平板的表面，用鑷子無(wú)菌取抗生素藥敏試紙片均勻等距貼在培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察并記錄不同藥物抑菌圈的直徑，判定該菌對(duì)不同藥物的敏感性。

2?結(jié)果與分析

2.1?細(xì)菌分離結(jié)果

在普通瓊脂培養(yǎng)基上18 h已長(zhǎng)出濕潤(rùn)、光滑的藍(lán)綠色菌落;在麥康凱培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，呈邊緣整齊、光滑的暗綠色菌落;鮮血瓊脂培養(yǎng)基中可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)良好，菌落周圍有溶血;可看到試管整體呈綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的表面有一層菌膜形成。

2.2?鑒定結(jié)果

2.2.1?細(xì)菌鑒定結(jié)果

經(jīng)革蘭氏染色后，鏡下可見(jiàn)無(wú)芽孢、中等大小的紅色桿菌。

2.2.2?生化鑒定結(jié)果

由表1可知，該菌發(fā)酵葡萄糖，不分解乳糖，三糖鐵不產(chǎn)生硫化氫，試管底部未變黃，甲基紅（M.R.）試驗(yàn)呈陰性，可分解尿素，能液化明膠，符合綠膿桿菌的生化特點(diǎn)。根據(jù)染色鏡檢特征和生化結(jié)果可確定該菌為綠膿桿菌。

2.3?致病性試驗(yàn)

2.3.1?BALB/c小鼠致病性試驗(yàn)

對(duì)照組精神狀態(tài)良好、行動(dòng)十分敏捷、被毛光滑。試驗(yàn)組接種細(xì)菌后7 h，小鼠全部出現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)遲緩現(xiàn)象;22 h 死亡1只，其余4只精神萎靡;45 h死亡2只，剩余2只被毛粗亂無(wú)光澤;96 h剩余2只小鼠有恢復(fù)跡象。綜上所述，共死亡3只小鼠，通過(guò)從死亡小鼠的肝臟釣菌，確定致病菌與接種菌一致。

2.3.2?鴿子致病性試驗(yàn)

對(duì)照組鴿子無(wú)異常，試驗(yàn)組鴿子接種24 h后糞便變?yōu)槟G色稀糞，精神無(wú)異常;48 h時(shí)試驗(yàn)組3羽鴿子出現(xiàn)精神沉郁、羽毛松亂、行動(dòng)遲緩、糞便為綠色水樣稀糞;觀察1周，無(wú)死亡。

2.4?藥敏試驗(yàn)

由表2可知，該菌對(duì)恩諾沙星、妥布霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星高度敏感，對(duì)丁胺卡那、阿奇霉素、復(fù)方新諾明中度敏感;而對(duì)青霉素、磺胺嘧啶等耐藥性較強(qiáng)。

3?討論與結(jié)論

綠膿桿菌在自然界土壤、空氣、水中分布廣泛，同時(shí)在各種動(dòng)物的腸道和皮膚中也有存在，是臨床常見(jiàn)的條件致病菌。綠膿桿菌在雞中常是霉形體、雞痘等的繼發(fā)菌，還可與大腸桿菌等細(xì)菌發(fā)生混合感染[12-13];在水貂中常與克雷伯氏菌混合感染引發(fā)水貂的出血性肺炎[14-15]。隨著現(xiàn)代養(yǎng)鴿業(yè)的飛速發(fā)展，綠膿桿菌在鴿群中也漸有報(bào)道，常與鴿痘、鴿新城疫等發(fā)生混合感染，導(dǎo)致鴿大量死亡[16-17]。

本研究從天津某賽鴿養(yǎng)殖場(chǎng)分離到1株細(xì)菌，通過(guò)培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性、染色鏡檢、生化鑒定確定其為綠膿桿菌。隨后進(jìn)行該菌的致病性研究，通過(guò)給小鼠、鴿子接種感染綠膿桿菌后發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)兩者的致病性不同，試驗(yàn)組小鼠的發(fā)病率為100%，病死率達(dá)60%，在臨床癥狀上表現(xiàn)比鴿子更為明顯，并且在剖檢過(guò)程中發(fā)現(xiàn)死亡小鼠整體腹部呈綠色，腸道黏液增多，其余癥狀不明顯;在鴿子的致病性試驗(yàn)中鴿子的發(fā)病率為60%，未發(fā)生死亡。

臨床中綠膿桿菌一般呈繼發(fā)感染，并且臨床癥狀缺乏明顯特征，由于在病程的不同階段表現(xiàn)出的臨床癥狀也不同，因此僅靠臨床癥狀不能判斷是否有綠膿桿菌感染，確診還須要借助實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定等手段。

在細(xì)菌性疾病的治療過(guò)程中，抗生素的耐藥性是經(jīng)常需要面臨的問(wèn)題。綠膿桿菌對(duì)多種抗生素均有耐藥性，并且不同菌株對(duì)同一抗生素的敏感性也不同。藥敏結(jié)果表明，此次分離的綠膿桿菌對(duì)恩諾沙星、妥布霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星均高度敏感。在后期治療的過(guò)程中，通過(guò)慶大霉素的治療，該公棚賽鴿的癥狀的確得到緩解。

臨床中一般在動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)易被繼發(fā)感染綠膿桿菌，該菌本身的致病性不強(qiáng)，但它對(duì)多種藥物均有耐藥性，因此在臨床中預(yù)防本病應(yīng)從改善養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件、加強(qiáng)獸醫(yī)衛(wèi)生措施著手，嚴(yán)格按照規(guī)定要求做好種蛋收集、保存及孵化全過(guò)程以及孵化設(shè)備、環(huán)境、注射疫苗器具的清洗和消毒工作。在養(yǎng)殖場(chǎng)通過(guò)飲水或拌料口服大劑量的慶大霉素等高度敏感藥物，對(duì)該菌亦有一定的防治作用。

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