刺梨GGP和DHAR基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)分析

李廣貴 林國都 胡玉乾 張懷山 白靜 安華明 魯敏

摘要：高含量的維生素C是刺梨果實(shí)的重要性狀，挖掘與維生素C含量相關(guān)聯(lián)的基因序列變異及單倍型對刺梨的品種改良具有指導(dǎo)意義。在21份野生刺梨資源中對GGP和DHAR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，分析基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)維生素C含量的相關(guān)性。GGP基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為2 035 bp的同源序列，其中包含22處變異位點(diǎn)，產(chǎn)生15種單倍型，在0.01顯著性水平上，3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）及Hap15與刺梨果實(shí)高含量維生素C相關(guān);在0.05顯著性水平上，3個(gè)SNP及Hap7與刺梨果實(shí)低含量維生素C相關(guān);GGP基因單倍型存在網(wǎng)狀進(jìn)化。DHAR基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為1 609 bp的同源序列，其中包含69處變異位點(diǎn)，產(chǎn)生9種單倍型，在0.05顯著性水平上，8個(gè)SNP、9個(gè)InDel及Hap9與刺梨果實(shí)中低含量維生素C相關(guān)，1個(gè)SNP及單倍型Hap4～Hap6與刺梨果實(shí)中高含量維生素C相關(guān);DHAR基因單倍型呈現(xiàn)扇形進(jìn)化。GGP基因具有更高的單倍型多樣性，DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性;GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：刺梨;維生素C;GGP基因;DHAR基因;基因序列多態(tài)性;單倍型;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)： S661.203.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0063-07

收稿日期：2019-03-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31660558）;貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2018053）;貴州大學(xué)SRT計(jì)劃（編號(hào)：2018244）。

作者簡介：李廣貴（1996—），男，貴州六盤水人，主要從事刺梨分子育種研究。E-mail：1119366514@qq.com。

通信作者：魯?敏，博士，副教授，主要從事果樹生物技術(shù)與遺傳育種研究。E-mail：48181266@qq.com。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科薔薇屬植物，原產(chǎn)于中國，因果實(shí)富含維生素C而成為研究維生素C代謝的熱門材料。研究表明，在所有合成路徑中，L-半乳糖途徑的GDP甘露糖表異構(gòu)酶（GME）基因的表達(dá)變化最能反映維生素C積累速率的變化;超量表達(dá)RrGME基因的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了6.2倍;而循環(huán)途徑的脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）基因的表達(dá)變化與維生素C的積累變化相似性最高，超量表達(dá)RrDHAR的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了9.7倍[1]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)刺梨中L-半乳糖途徑的半乳糖醛酸內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）和GDP半乳糖磷酸化酶（GGP）基因的表達(dá)特點(diǎn)與維生素C積累高度一致，進(jìn)一步將它們在煙草中過量表達(dá)使煙草葉片中的維生素C含量分別提高了1.1倍和20倍[2-4]。從受體植物維生素C含量的增加程度來看，RrGGP和RrDHAR等2個(gè)基因應(yīng)優(yōu)先當(dāng)選為刺梨維生素C代謝的關(guān)鍵酶基因，但有關(guān)它們在基因序列上的差異與維生素C含量之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系并不清楚。

關(guān)聯(lián)分析（association analysis）是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，研究群體基因型多態(tài)性與表型變異相關(guān)性，發(fā)掘和定位基因，并對基因及其等位基因進(jìn)行功能分析的重要工具[5]。根據(jù)掃描范圍，關(guān)聯(lián)分析可分為全基因組和候選基因2種途徑。湯佳樂等利用70對覆蓋全基因組的SSR引物，發(fā)現(xiàn)了與獼猴桃葉片及果實(shí)中的維生素C含量關(guān)聯(lián)的5個(gè)優(yōu)異標(biāo)記位點(diǎn)[6]。筆者所在課題組雖然前期也開發(fā)了大量SSR引物[7-11]，但由于缺乏刺梨遺傳連鎖圖譜數(shù)據(jù)，因此在SSR引物的選擇上具有隨機(jī)性，目前尚未篩選到與刺梨維生素C含量相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)。針對這種現(xiàn)狀，候選基因關(guān)聯(lián)分析是更適合刺梨的研究策略。而在蘋果上已有研究證明，GGP基因內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）是影響果實(shí)維生素C含量的主要決定因素[12]。因此，本研究對候選基因RrGGP和RrDHAR進(jìn)行基因序列多態(tài)性分析，并進(jìn)一步與維生素C含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為刺梨遺傳改良提供理論依據(jù)和分子工具。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)于2017、2018年8—9月進(jìn)行。從貴州省11個(gè)縣（市）采樣20份，四川省冕寧縣采樣1份（表1），樣本間距離大于50 m。每個(gè)采樣株均有全球定位系統(tǒng)（GPS）定位，并詳細(xì)記錄經(jīng)度、緯度、海拔高度。每株采取幼嫩葉片和成熟度及大小一致的有代表性的果實(shí)，以株為單位裝入做好標(biāo)記的自封袋中，放在冰盒內(nèi)，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮處理后于-70 ℃超低溫冰箱中冷凍保存，備用。

1.2?DNA提取和PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)材料基因組DNA的提取采用CTAB法[13]。GGP基因擴(kuò)增引物序列為正向5′-CATGCCATGGATGTTGAGGATCAAGAGGGTTCCCACTAT-3′，反向5′-GCTCTAGAACATAAACCCAAACG-3′[4]，DHAR基因擴(kuò)增引物序列為正向5′-CCACCTCATAAACTTGGCTGACA-3′，反向5′-TGTTTCTCTTCAGCGATGGTCTT-3′[1]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為40 μL，其中包括2×Mix 20 μL;ddH2O 16 μL;10 μmol/L的 Primer-F 及Primer-R各 1 μL;50 ng/μL的DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性4 min;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s;最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察拍照后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。將測序結(jié)果與GenBank中的序列利用BLAST工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對，以確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果的正確性。

1.3?AsA含量測定

參照白靜等的方法[14]，AsA含量采用高效液相色譜法測定。

1.4?數(shù)據(jù)分析

利用Lasergene 7.0軟件對正反向序列進(jìn)行拼接，參照Chromas序列峰圖對誤讀點(diǎn)進(jìn)行人工校正，并用軟件Clustal X進(jìn)行多序列對比[15]。利用DnaSP v5.1軟件進(jìn)行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性分析和單倍型分析[16]，以Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖;利用Structure 2.3.4軟件計(jì)算其最佳群體值K=2，取此時(shí)的群體結(jié)構(gòu)Q值作為協(xié)變量，以Tassel 2.1軟件進(jìn)行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?基因序列多態(tài)性分析

GGP基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為2 035 bp的同源序列，其中包含22處變異位點(diǎn)，11處為插入缺失標(biāo)記（Insert/Delete，InDel）類型，11個(gè)為SNP類型;DHAR基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為 1 609 bp 的同源序列，其中包含69處變異位點(diǎn)，53處為InDel類型，16個(gè)為SNP類型（表2）。DHAR基因具有較高的DNA多態(tài)性，多態(tài)性核苷酸位點(diǎn)數(shù)量、核苷酸差異平均數(shù)（k）、核苷酸多樣度（Pi）等參數(shù)分別為69、5.123 81和0.003 29。而GGP基因具有更高的單倍型多樣性，單倍型數(shù)量（Ha）、單倍型多樣度（Hd）等參數(shù)分別為15和0.900。

2.2?基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)AsA含量的關(guān)聯(lián)分析

對于GGP基因而言（表3），在0.01顯著性水平上，所檢測22處變異位點(diǎn)中，有3個(gè)SNP（267 T/A，305 T/G，420 G/T）與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān)，解釋率為0.319 1，在267 bp處為A堿基，305 bp 處為G堿基，420 bp處為T堿基是Hap15特有變異，它對應(yīng)的材料ZY-29在所有材料中維生素C含量最高，為 2 590.47 mg/100 g，表明Hap15可能控制刺梨果實(shí)高維生素C含量。在0.05顯著性水平上，有5處變異與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān)，其中3處為InDel類型（639-/G，989-/T，1 215-/T），2處為SNP類型（1 354 C/G，1 355 T/C），在639 bp處為G堿基，1 354 bp 處為G堿基，1 355處為C堿基是Hap7的特有變異，它對應(yīng)的材料LD-7中維生素C含量僅為987.59 mg/100 g，屬偏低水平，表明Hap7可能控制刺梨果實(shí)低維生素C含量。

對于DHAR基因而言（表4），在0.05顯著性水平上，所檢測的69處變異位點(diǎn)中，有19處與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān)，其中9處為InDel類型（399A/-，1 370-1 377 TCTGTAAG/—），10處為SNP類型（20 T/G，382 G/C，497 T/G，581 C/T，720 T/G，837 G/T，1 397 A/T，1 440 T/C，1 595 C/A，1 596 C/T，1 597 G/A）;在20 bp處為G堿基，382 bp 處為C堿基，399 bp處為缺失，497 bp處為G堿基，581 bp處為T堿基，720 bp處為G堿基，1 370～1 377 bp處插入TCTGTAAG，1 397 bp處為T堿基，1 595 bp處為A堿基，1 597 bp處為A堿基是單倍型Hap9的特有變異，它對應(yīng)的材料為 LD-7、XY-24、BJ-3、AL-20，維生素C含量范圍982.62～1 543.1 mg/100 g，平均值1 171.15 mg/100 g，屬中偏低水平，表明單倍型Hap9控制中低水平的AsA含量;1 440 bp處為C堿基是單倍型Hap4～Hap6的共有變異，對應(yīng)的材料ZY-29、MN-7、AL-17中AsA含量分別為2 590.47、1 652.57、1 668.35 mg/100 g，屬中偏高水平，表明單倍型Hap4～Hap6可能控制中高水平AsA含量。

綜合GGP基因和DHAR基因核苷酸多態(tài)性及單倍型結(jié)果來看（表3、表4），GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4同時(shí)在高含量維生素C材料ZY-29中檢測到，表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于低含量維生素C材料 LD-7中，表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

2.3?單倍型間的進(jìn)化分析

將所檢測到的15條野生刺梨GGP基因和9條DHAR基因單倍型序列，通過Network軟件構(gòu)建了Median Joining網(wǎng)絡(luò)聚類（圖1、圖2）。對于GGP基因而言，單倍型存在網(wǎng)狀進(jìn)化，Hap1位于網(wǎng)絡(luò)圖輻射化的中心，且包含了7個(gè)個(gè)體（表3），占試驗(yàn)材料的33.33%，分布最廣，是主要單倍型，可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型，其余Hap2～Hap15均為特有單倍型，僅存在于1個(gè)個(gè)體中（表3），Hap2、Hap5、Hap7、Hap8、Hap10、Hap11、Hap14、Hap15位于發(fā)散網(wǎng)絡(luò)圖的末端，說明它們是較晚發(fā)生變異而產(chǎn)生的單倍型。對于DHAR基因而言，單倍型進(jìn)化軌跡類似扇形，Hap1位于扇狀圖起始位點(diǎn)，包含8個(gè)個(gè)體（表4），占試驗(yàn)材料的38.10%，分布最廣，是主要單倍型，可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型，Hap3、Hap8、Hap9為共享單倍型，Hap2、Hap4～Hap7為特有單倍型，僅存在于1個(gè)個(gè)體中（表4），Hap2、Hap6、Hap7、Hap9位于發(fā)散網(wǎng)絡(luò)圖的末端，說明它們是較晚發(fā)生變異而產(chǎn)生的單倍型。GGP基因和DHAR基因網(wǎng)絡(luò)圖中出現(xiàn)的mv均表明一些單倍型在進(jìn)化過程中發(fā)生了丟失。

3?討論

在21份刺梨野生種質(zhì)中，ZY-29采于貴州省遵義市，位于最東端，在GGP基因和DHAR基因中呈現(xiàn)特異單倍型，分別為Hap15和Hap4;MN-7采于四川省冕寧縣，位于最西端，在GGP基因和DHAR基因中也呈現(xiàn)特異單倍型，分別為Hap8和Hap5。對GGP基因而言，東西兩端的試驗(yàn)材料ZY-29和MN-7對應(yīng)的單倍型Hap15和Hap8在系統(tǒng)進(jìn)化圖上也位于相反的分枝上，表明GGP基因單倍型的進(jìn)化可能與地理位置具有一定的相關(guān)性;而對DHAR基因而言，東西兩端的試驗(yàn)材料ZY-29和MN-7對應(yīng)的單倍型Hap4和Hap5在系統(tǒng)進(jìn)化圖上位于同一分枝，并進(jìn)化出Hap6（圖2），說明DHAR基因單倍型的進(jìn)化可能不受地理?xiàng)l件的影響。

維生素C積累的遺傳調(diào)控非常復(fù)雜，對維生素C代謝通路中的關(guān)鍵酶或限速步驟的研究即使在同一植物中也會(huì)存在差異[17-18]，在刺梨中也有相同的情況發(fā)生，從表觀遺傳學(xué)的角度，GGP和DHAR基因是爭議的焦點(diǎn)[1，4]。本研究通過分析刺梨GGP和DHAR基因在不同種質(zhì)中DNA序列的差異，從DNA水平研究2個(gè)基因與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)性，在0.01水平上，僅GGP基因中的3個(gè)SNP顯著地影響刺梨果實(shí)維生素C含量，但這3個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域;在0.05水平上，則GGP和DHAR基因均存在與果實(shí)維生素C含量顯著關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)，證明GGP和DHAR都是影響刺梨果實(shí)維生素C含量的關(guān)鍵基因，它們在DNA水平和表觀遺傳學(xué)方面都發(fā)揮了積極作用，在表觀遺傳學(xué)上，GGP基因是合成途徑的關(guān)鍵基因，而DHAR基因是循環(huán)再生途徑的關(guān)鍵基因。從DNA水平上來說，GGP基因具有更高的單倍型多樣性，DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性。DHAR基因在21個(gè)材料中產(chǎn)生了69處變異位點(diǎn)，其中53處為InDel類型（表2），涉及2段ATGCTATTCAAATGAATGAAGT序列，但這2段變異并未與刺梨果實(shí)維生素C含量顯著關(guān)聯(lián)（表4），而當(dāng)TCTGTAAG序列存在于DHAR基因時(shí)，刺梨果實(shí)可能維生素C含量較低?？傊?，刺梨果實(shí)維生素C含量可能由GGP和DHAR基因共同控制，當(dāng)GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于刺梨中時(shí)，可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

目前，刺梨在貴州的種植面積已達(dá) 13.33萬hm2，并計(jì)劃到2020年增加到 33.33萬hm2，但真正用于栽培的僅貴農(nóng)5號(hào)，隨著刺梨高端產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市場需求更高AsA含量的品種，但以此為育種目標(biāo)的品質(zhì)改良尚未真正開展，因此，本研究將對培育我國專用刺梨品種、加快刺梨品質(zhì)育種進(jìn)程起到一定的推動(dòng)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Huang M，Xu Q，Deng X X. L-Ascorbic acid metabolism during fruit development in an ascorbate-rich fruit crop chestnut rose （Rosa roxburghii Tratt.）[J]. Journal of Plant Physiology，2014，171（14）：1205-1216.

[2]An H M，F(xiàn)an W G，Chen L G，et al. L. Molecular characterisation and expression of l-galactono-1，4-lactone dehydrogenase and L-ascorbic acid accumulation during fruit development in Rosa roxburghii[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，2007，82（4）：627-635.

[3]Liu W，An H M. Overexpression of L-galactono-1，4-lactone dehydrogenase in tobacco plant enhances ascorbate accumulation and abiotic stress tolerance[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2013，35（5）：1617-1624.

[4]孫雅蕾，楊?曼，安華明. 刺梨GDP-L-半乳糖磷酸酶基因的表達(dá)及其與AsA積累的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2014，41（6）：1175-1182.

[5]Flint-garcia S A，Thornsberry J M，BucklerE S，et al. Structure of linkage disequilibrium in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2003，54（4）：357-374.

[6]湯佳樂，吳?寒，郎彬彬，等. 野生毛花獼猴桃果實(shí)表型性狀及SSR遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2014，41（6）：1198-1206.

[7]魯?敏，鄢秀芹，白?靜，等. 基于EST-SSR標(biāo)記與果實(shí)品質(zhì)性狀的貴州野生刺梨核心種質(zhì)構(gòu)建[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2017，44（8）：1486-1495.

[8]鄢秀芹，魯?敏，安華明. 刺梨轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其分子標(biāo)記開發(fā)[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2015，42（2）：341-349.

[9]張懷山，鄢秀芹，魯?敏，等. 基于ESR-SSR標(biāo)記的貴州野生刺梨居群遺傳多樣性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（6）：1098-1108.

[10]Yan X Q，Zhang X，Lu M，et al. De novo sequencing analysis of the Rosa roxburghii fruit transcriptome reveals putative ascorbate biosynthetic genes and EST-SSR markers[J]. Gene，2015，561（1）：54-62.

[11]Lu M，An H，Li L. Genome surveys equencing for the characterization of the genetic background of Rosa roxburghii Tratt. and leaf ascorbate metabolism genes[J]. PLoS One，2016，11（2）：e0147530.

[12]Mellidou I，Chagne D，Laing W A，et al. Allelic variation in paralogs of GDP-L-galactose phosphorylase is a major determinant of vitamin C concentrations in apple fruit[J]. Plant Physiology，2012，160（3）：1613-1629.

[13]Porebski S，Bailey G，Baum R B. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1997，15（1）：8-15.

[14]白?靜，張宗澤，魯?敏，等. 貴州不同地區(qū)野生刺梨果實(shí)品質(zhì)分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：43-46.

[15]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The Clustal-X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4888.

[16]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 2009，25（11）：1451-1452.

[17]Gilbert L，Alhagdow M，Nunes-nesi A，et al. GDP-D-mannose 3，5-epimerase （GME） plays a key role at the intersection of ascorbate and non-cellulosic cell-wall biosynthesis in tomato[J]. The Plant Journal，2009，60（3）：499-508.

[18]Ioannidi E，Kalamaki M S，Engineer C，et al. Expression profiling of ascorbic acid-related genes during tomato fruit development and ripening and in response to stress conditions[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60（2）：663-678.