呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備及免疫學(xué)特性鑒定

徐冬梅　李亞英　耿海波　李玉靜

摘 要：為建立呋喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide，SEM）的免疫學(xué)檢測方法，采用碳化二亞胺法成功合成人工免疫抗原SEM-牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）（SEM-BSA），并用該抗原免疫BALB/c小鼠，采用聚乙二醇介導(dǎo)的細胞融合技術(shù)制備SEM的單克隆抗體（SEM mAb），采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗，并對其效價、敏感性、特異性和親和力等免疫學(xué)特性進行鑒定。結(jié)果表明：成功制備SEM單克隆抗體SEM-3D9，抗體效價達到1∶5×106，敏感性半抑制質(zhì)量濃度為0.42 μg/L，亞型為IgG1，親和常數(shù)Ka=2.1×108 L/mol，與呋喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基-2-惡唑酮、呋喃它酮代謝物2-NP-5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮類似物的交叉反應(yīng)率（cross reaction，CR）均小于0.01%，與呋喃妥因代謝物2-NP-1-氨基-2-乙內(nèi)酰的CR為0.016 8%，特異性良好。

關(guān)鍵詞：呋喃西林代謝物;氨基脲;細胞融合;單克隆抗體;免疫學(xué)特性

Abstract： In order to establish an immunological method for the detection of the furacillin metabolite semicarbazide （SEM）， a conjugate of SEM with bovine serum albumin （BSA） was synthesized by the carbodiimide method and was used as an immunogen to immunize BALB/c mice for the preparation of a monoclonal antibody against SEM （SEM mAb） by polyethylene glycol （PEG）-mediated cell fusion. SEM mAb was purified by caprylic acid-ammonium sulfate precipitation. Finally， the immunological characteristics of the monoclonal antibody including titer， sensitivity， specificity and affinity were identified. The results showed that the monoclonal antibody SEM-3D9 was successfully prepared. The serum titer of immunized mice was 1：5 × 106， the sensitivity IC50 was 0.42 μg/L， and the antibody belonged to IgG1 subtype with an affinity constant Ka of 2.1 × 108 L/mol. Its cross-reaction rate with 2-NP-3-amino-2-oxazolidinone and 2-nitrophenyl-5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone analogues was less than 0.01%， and its cross-reaction rate with 2-nitrophenyl-1-aminohydantoin was 0.016 8%， indicating good specificity.

Keywords： furacillin metabolite; semicarbazide; cell fusion; monoclonal antibody; immunological characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191029-253

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）03-0058-05

呋喃西林是一種硝基呋喃類藥物，可抑制或殺滅多種革蘭氏菌以及某些真菌和原蟲，主要用于預(yù)防和治療腸道細菌感染，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用[1]，該類藥物及其代謝物屬于硝基雜環(huán)類化合物，具有細胞誘變性和動物致癌毒性[2]，已引起臨床高度重視，歐盟、日本和美國[3]等大部分國家和地區(qū)已禁止呋喃西林等4 種硝基呋喃類藥物在肉類食品中的殘留，我國在2002年也將該類抗生素列為食源性動物禁止使用藥物[4]。在4 種硝基呋喃類藥物中，呋喃西林類藥物殘留量最多[5]，毒性也最大[6]。在畜禽養(yǎng)殖過程中呋喃西林類藥物中毒事件時有報道[7-8]。呋喃西林在動物體內(nèi)會被迅速代謝[9]，不易檢測，其代謝產(chǎn)物氨基脲（semicarbazide，SEM）能與細胞內(nèi)蛋白長期結(jié)合，存留較長時間[10-12]，因此，通常將其代謝產(chǎn)物作為呋喃西林類藥物殘留檢測的標識物[13]。

目前，呋喃西林代謝物的檢測方法主要有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）等儀器方法，以及以酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析為主的免疫學(xué)分析方法[16-17]。傳統(tǒng)紫外分光光度法檢測靈敏度低，不能滿足微量代謝物檢測要求。HPLC、LC-MS等方法能隨時進行精確檢測[18-19]，靈敏、準確，主要作為確證方法，目前已出臺多項標準，如GB/T 18932.24—2005《蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了蜂蜜中呋喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS測定方法，SN/T 3648—2013《飼料中呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林含量的檢測方法 液相色譜法》規(guī)定了飼料中呋喃西林含量的HPLC檢測方法，GB/T 22987—2008《牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了牛乳和乳粉中呋喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS檢測方法，但該方法儀器設(shè)備昂貴、操作繁瑣、檢測成本高，不適合現(xiàn)場批量檢測，嚴重影響了使用此方法進行非法添加檢測的監(jiān)管和風(fēng)險預(yù)警。免疫學(xué)分析方法[20-21]具有快速、靈敏、準確、方便、檢測成本低、分析容量大等優(yōu)點，可以實現(xiàn)對目標物進行現(xiàn)場批量快速定性及定量分析，已成為目前最有效的初篩技術(shù)手段[22-25]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已開展了呋喃西林代謝物免疫學(xué)分析方法研究，但受抗體質(zhì)量的限制，方法的檢測靈敏度和特異性還有待提高，如吳鵬等[26]建立動物性食品中呋喃西林代謝物間接競爭ELISA法，該試劑盒標準曲線的半抑制質(zhì)量濃度（half inhibitory concentration，IC50）為0.267 7 μg/L;趙承彪[27]制備了抗呋喃西林多克隆抗體，抗體的敏感性IC50為10.5 μg/L。本研究采用碳化二亞胺法[28-29]合成SEM人工抗原，制備其高特異、靈敏的單克隆抗體，并對抗體的免疫學(xué)特性進行鑒定，為呋喃西林代謝物免疫學(xué)檢測方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨髓瘤SP2/0細胞 本研究室保存;BALB/c小鼠? ?河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

PEG4000、鹽酸氨基脲（SEM·HCl）、牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 生工生物工程（上海）股份有限公司;免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）亞型試劑盒?Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司;HAT選擇性培養(yǎng)基 美國Gibico公司;弗氏完全與不完全佐劑?Pierce生物技術(shù)公司;SEM與對羧基苯甲醛的衍生物（CPSEM）、SEM-BSA、SEM-OVA 本研究室自制;N-羥基琥珀酰亞胺 北京百靈威科技有限公司;1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;鄰醛基苯甲酸、對醛基苯甲酸 阿拉丁試劑（上海）有限公司;N，N-二甲基甲酰胺 上海麥克林生物化學(xué)有限公司;辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG 北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Qingegrallo超純水系統(tǒng) 德國密理博公司;BS 124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;NanoDrop 2000紫外掃描儀、Micro17超速離心機、Wellwash AC洗板機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-1F凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;IX51倒置顯微鏡 Olympus（中國）有限公司;MS105DU電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司;YDS-65-216液氮罐 成都金鳳液氮容器有限公司;Avanti JXN-26高速冷凍離心機 德國Beckman Coulter公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏設(shè)備有限公司;Varioskan LUX酶標儀 美國Bio-Tek儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SEM人工抗原的合成與鑒定

抗原合成采用碳化二亞胺法，鑒定采用紫外分光光度法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）法[30]，并采用朗伯-比爾定律計算偶聯(lián)比[31-32]。

1.3.2 動物免疫

用生理鹽水將免疫原CPSEM-BSA稀釋，與等體積弗氏不完全佐劑混勻后頸背部免疫BALB/c小鼠，免疫劑量為40 μg/只，免疫4 次，每次間隔2 周。第4次免疫1 周后取血，用間接ELISA法測定抗血清效價，競爭ELISA法測定抗血清是否敏感，最終選取效價高、敏感性好的免疫小鼠進行細胞融合。

1.3.3 雜交瘤細胞的制備

選擇敏感性好且血清效價高的小鼠進行腹腔加強免疫，3 d后用于細胞融合。采用間接和競爭ELISA法檢測融合細胞上清的抗體效價和對呋喃西林代謝物的抑制率，采用有限稀釋方法將陽性孔克隆化，直至成功建立單一分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株為止，將雜交瘤細胞株保存于-20 ℃待用。

1.3.4 單克隆抗體的制備與純化

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法獲取單克隆抗體。將篩選得到的能穩(wěn)定分泌SEM抗體的雜交瘤細胞（細胞數(shù)約為106 個/mL）注射到石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔，每只注射1 mL，7～10 d后取腹水。腹水采用辛酸-硫酸銨方法純化，并采用考馬斯亮藍法對純化的抗體質(zhì)量濃度進行測定[33]。

1.3.5 單克隆抗體抗效價測定

參照李春生等[34]的方法，采用間接ELISA法測定抗體效價。

1.3.6 單克隆抗體敏感性測定

將呋喃西林代謝物衍生物的標準品母液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋成質(zhì)量濃度分別為8.1、2.7、0.9、0.3、0.1 μg/L，采用間接競爭ELISA法檢測SEM抗體敏感性，以IC50表示[35]。

1.3.7 單克隆抗體免疫球蛋白亞型鑒定

使用單克隆抗體亞型試劑盒測定抗體亞型。

1.3.8 單克隆抗體親和常數(shù)（Ka）測定

采用間接ELISA法[36]測定Ka，按下式計算。

式中：ρ為當抗原質(zhì)量濃度為a時，吸光度最高值的50%所對應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;ρ為當抗原質(zhì)量濃度為b時，吸光度最高值的50%所對應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;a=nb;n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Statistica統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin制圖軟件繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的獲取

4 免后，3 只小鼠抗血清經(jīng)測定，效價均達到1∶105以上，敏感性IC50小于7 ng/mL。其中SEM-3號小鼠抗血清效價為1∶2×105，敏感性IC50小于1.5 ng/mL，選擇該小鼠加強免疫后用于細胞融合。融合5 板，融合率達到88.7%，陽性克隆率達到19.6%，經(jīng)亞克隆，篩選得到1 株能夠穩(wěn)定分泌SEM抗體的細胞株，命名為3D9。擴大培養(yǎng)后，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備腹水，腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后得到抗SEM單克隆抗體，命名為SEM-3D9，經(jīng)測定抗體質(zhì)量濃度為8.6 mg/mL。

2.2 SEM-3D9效價測定結(jié)果

P為待測陽性對照孔A450 nm）作為效價測定結(jié)果。由表1可知，當SEM-3D9稀釋比例為1∶512 000時，P/N為3.38，確定SEM-3D9的效價為1∶5×106。

2.3 SEM-3D9敏感性測定結(jié)果

用間接競爭ELISA法測定SEM-3D9對不同質(zhì)量濃度呋喃西林代謝物2-NP-二硝基苯甲醛酸脲（2-NP-benzaldehydesemicarbazone，NPSEM）的標準抑制曲線。以B/B0（%）（B為不同質(zhì)量濃度標準溶液的A450 nm，B0為零濃度標準溶液的A450 nm）為縱坐標，以標準溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)（lg ρNPSEM）為橫坐標，繪制標準抑制曲線，進行回歸分析，并計算IC50。結(jié)果表明，標準溶液質(zhì)量濃度0.1～8.1 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.992 7），IC50為0.42 μg/L。

2.4 SEM-3D9亞型測定結(jié)果

雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體與不同亞型的免疫球蛋白反應(yīng)后顯色有明顯差異。由圖1可知，SEM-3D9與IgG1抗體反應(yīng)的A450 nm最高，與IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA反應(yīng)的A450 nm小于0.5，為陰性，因此SEM-3D9單克隆抗體亞型為IgG1。

2.5 SEM-3D9 Ka測定結(jié)果

以SEM-3D9質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標，A450 nm為縱坐標繪制“S”型曲線。由圖2可知，SEM-3D9的Ka為2.1×108 L/mol。

2.6 SEM-3D9特異性測定結(jié)果

通過將SEM-3D9與NPSEM、呋喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基-2-惡唑酮（2-nitrophenyl-3-amino-2-oxazolidinone，NPAOZ）、呋喃它酮代謝物2-NP-5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（2-nitrophenyl-5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，NPAMOZ）、呋喃妥因代謝物2-NP-1-氨基-2-乙內(nèi)酰（2-nitrophenyl-1-aminohydantoin，NPAHD）分別進行交叉反應(yīng)，檢測SEM-3D9的特異性。計算交叉反應(yīng)率（cross reaction ratio，CR），表示為SEM-3D9的IC50與各結(jié)構(gòu)類似物的IC50比值。

由表2可知，SEM-3D9與NPAOZ、NPAMOZ的CR均小于0.01%，與NPAHD的CR為0.016 8%，特異性良好。

3 結(jié) 論

使用SEM-BSA作為抗原，免疫BALB/c小鼠，獲得分泌抗SEM特異性抗體的融合細胞，篩選出1 株效果較好的細胞株3D9。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水，采用辛酸-硫酸銨方法進行純化，得到單克隆抗體SEM-3D9。免疫學(xué)特性測定結(jié)果表明，SEM-3D9效價為1∶5×106，亞型為IgG1，Ka為2.1×108 L/mol，敏感性IC50為0.42 μg/L，與NPAOZ、NPAMOZ類似物的CR均小于0.01%，與NPAHD的CR為0.016 8%，特異性良好。本研究得到的高特異性、高靈敏度的SEM單克隆抗體為SEM代謝物殘留免疫檢測方法的建立提供了參考。

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