固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥的分析及基質(zhì)效應(yīng)研究

劉玲玲，孟甜甜，董希良，任 偉，張利鈞

(濟(jì)南市環(huán)境研究院，山東 濟(jì)南 250100)

有機(jī)氯農(nóng)藥(Organochlorine pesticides，OCPs)是公認(rèn)的環(huán)境中毒性最大的一類持久性有機(jī)污染物和疏水性有機(jī)污染物，被全面禁用后，其在環(huán)境介質(zhì)中的濃度顯著下降，但低水溶解性和強(qiáng)疏水性的特點(diǎn)使之易吸附在懸浮顆粒物上，并最終累積在沉積物和土壤中[1]。土壤作為OCPs的主要匯和儲(chǔ)蓄庫(kù)[2]，不僅具有較強(qiáng)的滯留能力，而且還可作為其他介質(zhì)的污染源將其重新排放到大氣、地下水和生物體等環(huán)境中[3]，并通過生物積累和放大效應(yīng)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成廣泛而持久的影響[4]。如已禁用的滴滴涕、六六六等有機(jī)氯農(nóng)藥因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠長(zhǎng)期殘留在土壤中，目前仍被頻繁檢出[5]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥的方法尤為重要。

土壤中農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要包括樣品前處理和儀器分析兩個(gè)部分，其中前處理包括提取和凈化兩種方式，提取方式主要為索氏提取(Soxhlet extraction)[4]、超聲提取(Ultrasound extraction)[6]、微波提取(Microwave extraction)[7]、快速溶劑萃取(Accelerated solvent extraction,ASE)[8]及QuEChERS方法[5]等，ASE因具有提取速度快、溶劑消耗量少、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，受到越來越多研究工作者的青睞[8-9]，國(guó)內(nèi)外很多標(biāo)準(zhǔn)方法也優(yōu)先推薦該方式[10-11]。凈化方式主要有固相萃取(Solid phase extraction,SPE)凈化[9]、凝膠色譜凈化(Gel permeation chromatography，GPC)[12]方式。其中GPC可同時(shí)對(duì)多種物質(zhì)凈化，但溶劑消耗量大、耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合批量分析。而SPE凈化溶劑消耗量小、可自動(dòng)化批量處理、操作簡(jiǎn)單。有機(jī)氯農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)主要有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5]等，GC-MS由于分析速度快、定性能力強(qiáng)，近年來得到廣泛應(yīng)用[13-14]。

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)殘檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象，這主要取決于農(nóng)藥的種類、樣品類型、檢測(cè)儀器原理等多個(gè)方面。農(nóng)藥的極性及熱穩(wěn)定性是影響基質(zhì)效應(yīng)的重要因素，同一農(nóng)藥在不同樣品中的基質(zhì)效應(yīng)也有差異[15]，GC-MS檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)主要是農(nóng)藥與硅醇基及其與玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所致[16]。對(duì)于不同的農(nóng)藥及樣品類型，常用的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)方法有基質(zhì)凈化法[17-18]、同位素標(biāo)記法[19-20]、基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法[21-22]、加入分析保護(hù)劑法[23-24]，而GC-MS檢測(cè)中常采用優(yōu)化進(jìn)樣技術(shù)的方式進(jìn)行基質(zhì)補(bǔ)償[13]，實(shí)際研究工作中常將多種補(bǔ)償方法相結(jié)合?；|(zhì)匹配校準(zhǔn)法因并未減弱基質(zhì)效應(yīng)，且無法獲得適用于所有基質(zhì)的統(tǒng)一空白基質(zhì)，故存在一定缺陷。基質(zhì)凈化法則從根本上消除可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的共提物，凈化效果越好，待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液類型越相近，檢測(cè)結(jié)果受基質(zhì)效應(yīng)影響的程度就越小，在各種凈化方式中，SPE小柱凈化效果更為理想[15]。優(yōu)化進(jìn)樣技術(shù)無需復(fù)雜的操作即可達(dá)到降低基質(zhì)效應(yīng)的目的。目前農(nóng)殘基質(zhì)效應(yīng)的研究主要集中在農(nóng)產(chǎn)品中[13,18-21,23-24]，而對(duì)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的研究報(bào)道較少。本研究通過分析不同SPE凈化溶劑和不同進(jìn)樣方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用，篩選出最優(yōu)預(yù)處理方法，旨在為我國(guó)土壤環(huán)境中OCPs的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B/5977B GC-MS儀(美國(guó)安捷倫公司)；ASE350快速溶劑萃取儀(美國(guó)賽默飛公司)；M10平行蒸發(fā)濃縮儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫公司)；Alpha 1-4LDplus冷凍干燥儀(德國(guó)Christ公司)；RM200土壤臼式研磨儀、AS200土壤篩分儀(德國(guó)萊馳公司)；Milli-Q超純水機(jī)(德國(guó)默克公司)。

正己烷、丙酮、二氯甲烷(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；弗羅里硅土小柱(500 mg/6 mL，美國(guó)安捷倫公司)；無水硫酸鈉及石英砂顆粒(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；硅藻土顆粒(30～40目，美國(guó)賽默飛公司)。

α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDT、p,p′-DDD、六氯苯、α-氯丹、γ-氯丹、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、α-硫丹、β-硫丹、滅蟻靈、七氯、環(huán)氧化七氯、異狄氏劑醛、硫丹硫酸酯、異狄氏劑酮、甲氧滴滴涕23種有機(jī)氯農(nóng)藥混標(biāo)(質(zhì)量濃度均為1 000 μg·mL-1，美國(guó)AccuStandard公司)；標(biāo)準(zhǔn)替代物：四氯間二甲苯、氯茵酸二丁酯和十氯聯(lián)苯的混標(biāo)(2 000 μg·mL-1)及內(nèi)標(biāo)(五氯硝基苯,1 000 μg·mL-1)均購(gòu)于美國(guó)o2si公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品采集與制備采集表層土壤(0～20 cm)至潔凈的棕色玻璃瓶中，將采樣瓶裝滿、裝實(shí)，密封，于4 ℃下避光冷藏保存，保存時(shí)間不超過10 d。取適量樣品混勻，經(jīng)-55 ℃冷凍干燥后，用土壤臼式研磨儀研磨，過250 μm金屬網(wǎng)篩混勻后，置于棕色瓶中備用。

1.2.2 樣品提取與凈化提?。涸谳腿∏?34 mL)底部放置專用的玻璃纖維濾膜，濾膜上鋪一層硅藻土顆粒。準(zhǔn)確稱取20.00 g樣品，均勻混入硅藻土顆粒，同時(shí)加入15 μL 200 μg·mL-1替代物的混標(biāo)中間液，用硅藻土填滿萃取池，于加速溶劑萃取儀中萃取，萃取溶劑為正己烷∶丙酮(體積比1∶1)；載氣(高純氮?dú)?壓力：1.0 MPa；萃取溫度：100 ℃；萃取池壓力：10 MPa；預(yù)加熱平衡時(shí)間：3 min；靜態(tài)萃取時(shí)間：5 min；放氣時(shí)間：2 min；循環(huán)次數(shù)：2次；總萃取時(shí)間：22 min。萃取液收集于250 mL接收瓶中，待凈化。

凈化：向弗羅里硅土小柱中加入無水硫酸鈉及經(jīng)硝酸處理過的銅粉，分別用5 mL二氯甲烷、10 mL正己烷預(yù)淋洗弗羅里硅土小柱，然后將1 mL提取液移入柱內(nèi)，用10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)進(jìn)行洗脫，待洗脫液全部流出至濃縮杯中后，將其濃縮至約1 mL，再加入3 mL正己烷清洗濃縮杯內(nèi)壁，再濃縮至1 mL以下，將溶劑完全轉(zhuǎn)換為正己烷。加入8 μL內(nèi)標(biāo)物并準(zhǔn)確定容至1.0 mL，待測(cè)。

1.3 GC-MS條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力275.8 kPa；進(jìn)樣量：2.0 μL，柱流量：1.0 mL/min(恒流)；程序升溫：初始溫度120 ℃，保持1 min；以12 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以7 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，再以1 ℃/min升至250 ℃，保持2 min，最后以15 ℃/min升至300 ℃，保持2 min。

圖1 23種有機(jī)氯、3種替代物及1種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig.1 TIC of 23 organochlorine pesticides,3 surrogate standards and internal standard the number 1-23 were the same as those in Table 1

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度：230 ℃；掃描方式：選擇離子掃描模式；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用HP-5ms毛細(xì)管色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離，通過全掃描(Scan)和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式進(jìn)行測(cè)定，選擇豐度高、干擾低的特征離子為定量離子，豐度較高、干擾較低的2個(gè)特征離子為定性離子。23種有機(jī)氯的SIM離子及保留時(shí)間見表1，總離子流色譜圖如圖1所示。

表1 23種有機(jī)氯農(nóng)藥保留時(shí)間與SIM 離子Table 1 Retention times and selected-ion monitoring ions of 23 organochlorine pesticides

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

回收率主要取決于ASE提取溶劑及凈化時(shí)洗脫溶劑的選擇。因此，采用分步加標(biāo)的方式考察了加速溶劑萃取及凈化步驟的回收率。

2.2.1 ASE提取溶劑的確定本研究參考環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)方法《土壤和沉積物 有機(jī)氯農(nóng)藥的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》(HJ835-2017)[25]，采用正己烷∶丙酮(體積比1∶1)對(duì)添加4 μg·mL-1有機(jī)氯混標(biāo)的硅藻土進(jìn)行提取，計(jì)算其回收率。結(jié)果顯示，23種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率為59.7%～114%，可滿足分析要求。因此，實(shí)驗(yàn)選擇正己烷∶丙酮(體積比1∶1)為ASE的提取溶劑。與宋曉娟[8]、陶鑫[26]、黃志[27]等的研究結(jié)果一致。

2.2.2 SPE洗脫溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)考察了20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)、20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)、10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑時(shí)對(duì)回收率的影響。結(jié)果顯示，20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)對(duì)19種(占總檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥的82.6%)有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率較高(>80%)，在該洗脫劑條件下，Kruskal-Wallis(K-W)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果表明，17種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率顯著高于其它兩種洗脫劑的回收率(p<0.05)，4種農(nóng)藥的回收率則顯著低于其它2種洗脫劑，介于40.9%～63.2%之間，六氯苯和甲氧滴滴涕回收率差異則不顯著。10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑的回收率介于其它兩種洗脫劑之間，回收率為76.7%～121%。20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)洗脫時(shí)的回收率為62.1%～90.9%，顯著低于前兩種(p<0.05)。為保證大部分有機(jī)氯農(nóng)藥有較好的回收率，選擇10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為凈化的洗脫劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)的計(jì)算公式采用公式[28]：ME=(Am/As-1)×100%，式中Am為基質(zhì)中農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，As為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，無需采取補(bǔ)償措施；20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，須采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[29]。本研究比較了同為4 μg·mL-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與土壤基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值，研究發(fā)現(xiàn)，p,p′-DDD、o,p′-DDT、異狄氏劑醛、異狄氏劑酮呈現(xiàn)中等程度的基質(zhì)效應(yīng)，p,p′-DDT、異狄氏劑、甲氧滴滴涕則存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，需采取補(bǔ)償措施，因此分析了基質(zhì)凈化法和不同進(jìn)樣方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用。

2.3.1 不同洗脫溶劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用洗脫溶劑是凈化條件中最主要的影響因素，不同洗脫溶劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償作用也不同。本研究分析了20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)、20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)、10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9) 3種洗脫溶劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，采用凈化措施后，大部分有機(jī)氯農(nóng)藥的ME均有所降低，且以10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑時(shí)對(duì)中、強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)農(nóng)藥的基質(zhì)補(bǔ)償效果最好，18種有機(jī)氯農(nóng)藥(占比78.3%)的基質(zhì)效應(yīng)在20%以內(nèi)。其中，p,p′-DDD、異狄氏劑酮由中等程度基質(zhì)效應(yīng)降為弱基質(zhì)效應(yīng)，p,p′-DDT、甲氧滴滴涕由強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)降為中等程度基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2 進(jìn)樣方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響在氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)過程中，不同的進(jìn)樣模式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響有著巨大的差別[15]。非脈沖和脈沖不分流進(jìn)樣是GC-MS中最常用的進(jìn)樣技術(shù)，在脈沖不分流進(jìn)樣方式中，脈沖壓力是最重要的參數(shù)[13]。按照儀器條件對(duì)凈化后的土壤基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，考察了非脈沖不分流進(jìn)樣和脈沖不分流進(jìn)樣對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，脈沖進(jìn)樣的ME整體上較非脈沖進(jìn)樣低，所有農(nóng)藥的|ME|均在50%以內(nèi)，不存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。賀利民等[30]的研究也指出，脈沖不分流進(jìn)樣技術(shù)能夠大大減少基質(zhì)效應(yīng)。

在脈沖進(jìn)樣方式中，脈沖壓力為103.4、172.4、275.8 kPa時(shí)的|ME|值在20%以內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量分別為18、19、23，由此可見，隨著柱頭壓力的增大，其對(duì)應(yīng)的基質(zhì)效應(yīng)整體呈減弱趨勢(shì)，特別是對(duì)異狄氏劑和滅蟻靈的基質(zhì)減弱作用較為明顯。這是因?yàn)殡S著進(jìn)樣過程中流速的增加和進(jìn)樣口壓力的增大，樣品在進(jìn)樣口的停留時(shí)間減少[30]，減少了目標(biāo)物與襯管中活性位點(diǎn)的作用時(shí)間，從而降低了基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限在優(yōu)化凈化條件和進(jìn)樣方式下，23種有機(jī)氯農(nóng)藥均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，可采用溶劑配標(biāo)法進(jìn)行定量，用正己烷將23種有機(jī)氯農(nóng)藥及替代物混標(biāo)分別稀釋成0.4、1、2、3、4、6、8、10 μg·mL-1，均加入8 μL內(nèi)標(biāo)物(1 000 μg·mL-1)，最終質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1。通過保留時(shí)間和NIST譜庫(kù)檢索對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性分析，采用內(nèi)標(biāo)法定量。23種有機(jī)氯在0.4～10 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于0.999 2，校準(zhǔn)曲線中目標(biāo)物相對(duì)響應(yīng)因子(RRF)的RSDRRF為0.34%～9.8%。按照《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168-2010)[31]中規(guī)定，方法檢出限(LOD)=3.143δ(δ為7個(gè)空白加標(biāo)平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差)，方法定量下限(LOQ)為4倍的LOD。本研究中23種有機(jī)氯農(nóng)藥的LOD為1.0～8.6 μg·kg-1，LOQ為4.0～34.4 μg·kg-1(表2)。

2.4.2 回收率及精密度在空白土壤中分別添加20、60、100 μg/kg的23種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行6個(gè)，在優(yōu)化條件下測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，23種農(nóng)藥在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為46.3%～127%，RSD為0.68%～15%(表2)，回收率滿足40%～150%的要求[25]，具有良好的準(zhǔn)確度及精密度。

表2 23 種有機(jī)氯農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)(r2)、RRF的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDRRF)、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限及定量下限Table 2 Linear coefficients(r2),relative standard deviations of RRF(RSDRRF),average recoveries,RSDs,limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of 23 organochlorine pesticides

圖2 實(shí)際土樣的色譜圖Fig.2 Chromatogram of soil sample the number 1-23 were the same as those in Table 1

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在優(yōu)化條件下，采用本法對(duì)采集自濟(jì)南市某基地(36°41′10″N,117°4′45″E)的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出5種農(nóng)藥(圖2)，分別為α-六六六、γ-六六六、p,p′-DDE、異狄氏劑醛、p,p′-DDT，含量為3.91～11.3 μg·kg-1。

3 結(jié) 論

本文建立了一種固相萃取/GC-MS同時(shí)測(cè)定土壤中23種有機(jī)氯農(nóng)藥的分析方法，并考察了凈化方式及進(jìn)樣條件對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，該方法操作簡(jiǎn)單、高效，可用于復(fù)雜土壤樣品的分析。