羥基吡啶功能化螺吡喃探針檢測(cè)尿樣中檸檬酸的研究

霍志銘，何汶懿，王 婕，夏 凌，肖小華，李攻科

(中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，對(duì)大部分需氧細(xì)胞而言，檸檬酸是檸檬酸循環(huán)(Krebs循環(huán))中的重要代謝物[1]。Giske?degad?rd等[2]的研究表明，惡性前列腺癌組織中檸檬酸含量較良性組織低，檸檬酸可作為前列腺癌的生物標(biāo)志物(Biomarker)之一，其在組織中的濃度可用于評(píng)估前列腺癌的等級(jí)。尿液中的檸檬酸含量可用來(lái)鑒別診斷腎結(jié)石[3]和腎小管酸中毒，在骨骼疾病診斷中也發(fā)揮著重要作用[4]。檸檬酸的分析方法主要有氣相色譜(GC)法[5]、高效液相色譜(HPLC)法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]和穩(wěn)定同位素比值法[8]等。但這些方法存在耗時(shí)、操作復(fù)雜和儀器設(shè)備昂貴[9]等不足，發(fā)展新型、快速、準(zhǔn)確、可視化定量檢測(cè)檸檬酸的方法具有重要意義。

螺吡喃(Spiropyran,SP)[10]是目前研究廣泛的有機(jī)光致變色材料之一，其分子由互相垂直的吲哚啉和苯并吡喃兩部分通過(guò)螺碳結(jié)合，有螺吡喃和部花菁(Merocyanine,MC)兩種形態(tài)。無(wú)色的SP態(tài)螺吡喃在紫外光激發(fā)下，分子的螺碳與相鄰氧原子的C—O鍵發(fā)生斷裂，開(kāi)環(huán)異構(gòu)化為有色的MC態(tài)。MC態(tài)螺吡喃在可見(jiàn)光或熱激發(fā)下，分子重新閉環(huán)，變回?zé)o色的SP態(tài)[11]。SP態(tài)螺吡喃的吸收光譜表現(xiàn)出兩個(gè)峰，在272 nm處和351 nm處分別為吲哚啉和苯并吡喃的π-π*電子躍遷；而MC態(tài)螺吡喃由于部花菁的共軛結(jié)構(gòu)，在568 nm的可見(jiàn)光處有明顯吸收峰出現(xiàn)[12]。螺吡喃作為分子探針在分析化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如用于金屬離子[13-14]、親核性陰離子[15]和氨基酸[16]等的檢測(cè)。

開(kāi)環(huán)態(tài)螺吡喃的螺碳位為三級(jí)碳正離子，受親核試劑的進(jìn)攻易發(fā)生加成反應(yīng)[12]。因此，親核性的檸檬酸可作為螺吡喃的目標(biāo)物并與之進(jìn)行特異性結(jié)合。此外，生物樣品中螺吡喃探針的水溶性及其與樣品的結(jié)合作用強(qiáng)度是影響探針實(shí)際應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。針對(duì)這些問(wèn)題，本文采用羥基吡啶基團(tuán)對(duì)傳統(tǒng)螺吡喃探針進(jìn)行功能化，實(shí)現(xiàn)了探針?biāo)苄约皩?duì)目標(biāo)檸檬酸響應(yīng)能力的共同提高。通過(guò)引入羥基吡啶基團(tuán)，增強(qiáng)了螺吡喃與水的氫鍵作用及探針的水溶性。此外，檸檬酸與羥基吡啶基團(tuán)的螯合作用及對(duì)探針螺碳正離子的親核加成作用，協(xié)同提高了探針的響應(yīng)能力，據(jù)此建立了尿樣中檸檬酸的熒光檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀及Bruker AVANCE 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、RF-5301PC熒光分光光度計(jì)和LCMS-8050三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司)。

2,3,3-三甲基吲哚、5-硝基水楊醛、3-羥基吡啶、KOH(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；NaOH、Na2SO4、醋酸、濃鹽酸、NaCl、檸檬酸、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、乙醇、四氫呋喃、CHCl3、丙酮、甲醇、CH2Cl2(廣州化學(xué)試劑廠)；MnO2(活化)、氘代氯仿、氘代二甲基亞砜(北京百靈威科技有限公司)；碘甲烷(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；哌啶(永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司)；SnCl2·2H2O(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醛水溶液(西隴科學(xué)股份有限公司)。以上試劑均為分析純。99.5%人工尿液(廣州學(xué)友生物科技有限公司)。

1.2 羥基吡啶功能化螺吡喃探針合成路線

羥基吡啶功能化螺吡喃(Hydroxypyridine functionalized spiropyran，HFS)探針1A的合成路線如圖1所示。根據(jù)文獻(xiàn)[11]制備化合物1b；化合物1b與5-硝基水楊醛反應(yīng)得到化合物1c。用SnCl2·2H2O作為還原劑將1c氨基化制備中間物2c。另一方面，將3-羥基吡啶與甲醛經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后得到另一中間物2d[17-18]?；衔?c和2d在常溫下反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物HFS探針1A[11]?；衔?f按文獻(xiàn)[19]合成。采用1H NMR、13C NMR和質(zhì)譜表征化合物1c、1A和1f。

化合物1c：1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.02(d,J=8.6 Hz,2H),7.21(d,J=1.3 Hz,1H),7.10(dd,J=7.2,1.2 Hz,1H),6.93(d,J=10.4 Hz,1H),6.89(td,J=7.4,0.9 Hz,1H),6.77(d,J=8.5 Hz,1H),6.57(d,J=7.7 Hz,1H),5.87(d,J=10.3 Hz,1H),2.75(s,3H),1.30(s,3H),1.20(s,3H)。

化合物1A：1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ13.30(d,J=44.3 Hz,1H),8.83(s,1H),8.31 ～8.16(m,1H),7.33(dd,J=8.4,1.4 Hz,1H),7.19(t,J=2.1 Hz,1H),7.18 ～7.15(m,1H),7.13(d,J=2.7 Hz,1H),7.09(dd,J=7.4,1.2 Hz,1H),6.94 ～6.83(m,2H),6.78(d,J=8.6 Hz,1H),6.55(d,J=7.7 Hz,1H),5.78(d,J=10.2 Hz,1H),2.76(d,J=2.0 Hz,3H),1.34(d,J=2.3 Hz,3H),1.19(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ160.87,158.12,154.55,148.08,141.19,139.67,137.62,136.58,128.99,127.69,126.19,124.72,122.81,121.54,120.66,119.80,119.32,115.99,106.90,104.85,60.41,51.95,28.96,25.91,20.16。MS:M=396.2m/z,理論Mt=397.5m/z。

化合物1f：1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ12.20(s,1H),8.19(d,J=2.8 Hz,1H),7.98(dd,J=9.0,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=10.4 Hz,1H),7.11(t,J=7.5 Hz,2H),6.84(d,J=9.0 Hz,1H),6.78(t,J=7.4 Hz,1H),6.64(d,J=7.8 Hz,1H),5.98(d,J=10.4 Hz,1H),3.42-3.22(m,4H),1.17(s,3H),1.06(s,3H)。

圖1 HFS探針1A以及參比探針1c、1f的合成路線Fig.1 Synthesis route of HFS probe 1A and reference probes 1c and 1f

1.3 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的光譜測(cè)定

測(cè)定40 μmol/L HFS探針1A乙腈-水溶液(1∶1，體積比)的紫外可見(jiàn)吸收光譜及熒光光譜，光譜測(cè)定過(guò)程中采用365 nm 3 W外置光源對(duì)溶液進(jìn)行激發(fā)。此外，將40 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液與2 000 μmol/L檸檬酸水溶液以1∶1(體積比)比例混合，在35 ℃下超聲反應(yīng)3 min。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)溶液進(jìn)行紫外可見(jiàn)吸收光譜及熒光光譜測(cè)定。其中熒光光譜測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為380 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

1.4 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的抗干擾實(shí)驗(yàn)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別將濃度為20.0、30.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 μmol/L的檸檬酸水溶液與80 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液以1∶1(體積比)比例混合，于35 ℃下超聲反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定溶液在280 nm紫外激發(fā)下于380 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

1.6 人工尿液中檸檬酸回收率的測(cè)定

配制分別含有40.0、50.0、60.0 μmol/L的檸檬酸的水-人工尿液混合溶液，其中人工尿液占2.5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)。分別將該檸檬酸水溶液與80 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液以1∶1(體積比)比例混合，于35 ℃水浴中超聲反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定溶液在280 nm紫外激發(fā)下于380 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算檸檬酸回收率。

1.7 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A與檸檬酸反應(yīng)的 Job's plot曲線

在室溫下，將不同濃度的HFS探針1A的乙腈溶液與檸檬酸水溶液按1∶1(體積比)比例混合，反應(yīng)至平衡后測(cè)定380 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中HFS探針1A及檸檬酸的總濃度維持在80 μmol/L。

1.8 3種螺吡喃探針與檸檬酸結(jié)合能力對(duì)比實(shí)驗(yàn)

分別在40 μmol/L參比探針1c、1f和HFS探針1A的乙腈溶液中加入2 000 μmol/L的檸檬酸水溶液(1∶1，體積比)，25 ℃下反應(yīng)20 min，對(duì)比溶液變色情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的結(jié)構(gòu)表征

按HFS探針1A的原子編號(hào)(圖2A)，通過(guò)核磁共振譜圖并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

圖2 HFS探針1A的結(jié)構(gòu)及原子編號(hào)(A)、核磁共振氫譜(B)、核磁共振碳譜(C)圖及質(zhì)譜(D)Fig.2 Structural sketch with atomic number(A),1H NMR(B),13C NMR(C) and MS(D) of HFS probe 1A the corresponding atoms of HFS probe 1A are labeled in the 1H NMR and 13C NMR spectra(核磁氫譜及碳譜上對(duì)HFS探針1A原子的化學(xué)位移依編號(hào)作了歸屬)

從圖2B可知，編號(hào)10～12的3個(gè)甲基(1.2、1.3、2.8 ppm)及編號(hào)為16、17兩個(gè)烯基(5.8、7.1 ppm)是螺吡喃骨架的特征峰，而編號(hào)30的酚基(13.4 ppm)、編號(hào)23的亞氨基(8.8 ppm)及編號(hào)28的吡啶基N-鄰位H(8.2 ppm)則是羥基吡啶功能團(tuán)的特征基團(tuán)。圖2C的核磁碳譜提供了相似的證明結(jié)果，從圖中能清晰區(qū)分不同碳原子的歸屬。結(jié)合質(zhì)譜的分子離子峰數(shù)據(jù)M=396.2m/z(理論Mt=397.5m/z，圖2D)，可證明HFS探針1A的結(jié)構(gòu)如圖2A所屬。

2.2 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A光致變色性能研究

HFS探針1A的溶液在365 nm紫外照射下可發(fā)生由無(wú)色變成黃色(圖3A)的現(xiàn)象。其380 nm處的吸收峰強(qiáng)度大幅下降，并在480 nm處出現(xiàn)新的吸收峰。顯然，HFS探針1A在紫外光激發(fā)下發(fā)生了異構(gòu)化開(kāi)環(huán)，由SP態(tài)轉(zhuǎn)變成MC態(tài)。MC態(tài)下的HFS探針1A分子呈平面大共軛結(jié)構(gòu)，與SP態(tài)結(jié)構(gòu)相比能級(jí)差降低，吸收峰紅移，因此在低頻區(qū)產(chǎn)生新吸收峰。除變色以外，經(jīng)紫外照射開(kāi)環(huán)化的HFS探針1A的熒光光譜也發(fā)生了相應(yīng)的變化(圖3B)，其380 nm處的特征熒光峰發(fā)生了15 nm的紅移。綜上所述，HFS探針1A具有光致異構(gòu)化的性能，可在紫外光下發(fā)生顏色及熒光特性的改變。利用該特性作可視化指示信號(hào)，能有效構(gòu)建基于異構(gòu)化響應(yīng)的檢測(cè)方法。

考察了HFS探針1A對(duì)檸檬酸的響應(yīng)能力。結(jié)果表明，加入檸檬酸后HFS探針1A溶液從無(wú)色變?yōu)榧t色，在480 nm處出現(xiàn)新吸收峰(圖3C)。除變色外，體系還發(fā)生了明顯的熒光猝滅現(xiàn)象(圖3D)，380 nm處的特征熒光峰基本消失。因此，基于HFS探針1A對(duì)檸檬酸響應(yīng)前后的變色及熒光改變特性，可構(gòu)建對(duì)檸檬酸的檢測(cè)方法。

2.3 檸檬酸測(cè)定條件優(yōu)化

研究了HFS探針1A測(cè)定檸檬酸的最佳反應(yīng)溫度、光激發(fā)條件和pH值。圖4A表明，HFS探針1A對(duì)20 μmol/L檸檬酸的熒光變化受溫度影響較小，不同溫度下反應(yīng)60 min的各組熒光相對(duì)猝滅值ΔIF380nm穩(wěn)定在180～202.6之間。綜合考慮操作難度及性能，選擇恒溫水浴35 ℃下反應(yīng)60 min。從圖4A還可得知，同溫度下HFS探針1A溶液與檸檬酸的反應(yīng)無(wú)需紫外光激發(fā)，說(shuō)明HFS探針1A對(duì)檸檬酸有較強(qiáng)的結(jié)合及響應(yīng)能力。HFS探針1A在不同pH值環(huán)境下與1 000 μmol/L檸檬酸反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度及熒光猝滅比例如圖4B所示，由圖可見(jiàn)，pH≤6.0下響應(yīng)不明顯，溶液的熒光無(wú)顯著變化；pH 7.0時(shí)，HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)后相對(duì)熒光猝滅值達(dá)到最大(0.91)。該熒光猝滅響應(yīng)是檸檬酸根離子與HFS探針MC態(tài)螺碳(8號(hào)位，圖2A)的親核加成及與羥基吡啶螯合協(xié)同作用的結(jié)果。值得注意的是，酸性條件下HFS探針1A的MC態(tài)更穩(wěn)定，而檸檬酸根則相反；從實(shí)驗(yàn)可知，pH 7.0是兩者達(dá)到平衡的最佳pH值。因此，HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)的最佳條件為pH 7.0且無(wú)需紫外照射，恒溫水浴35 ℃下反應(yīng)60 min。

圖3 HFS探針1A溶液(40 μmol/L)經(jīng)365 nm紫外光激發(fā)前后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(A)和熒光光譜(B)以及加入2 000 μmol/L檸檬酸前后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(C)和熒光光譜(D)Fig.3 UV-visible absorption spectra(A) and fluorescence spectra(B) of HFS probe 1A solution(40 μmol/L) before and after being excited by 365 nm ultraviolet light,and UV-visible absorption spectra(C) and fluorescence spectra(D) before and after adding citric acid(2 000 μmol/L)insert C:color changes of HFS probe 1A solution before and after adding citric acid

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.5 人工尿樣中檸檬酸含量的檢測(cè)

在最佳反應(yīng)條件下，HFS探針1A對(duì)檸檬酸有靈敏的響應(yīng)特性，且伴隨著顏色和熒光強(qiáng)度的變化。其中熒光的猝滅特征最為明顯，可用于高靈敏的定量分析。據(jù)此建立了HFS探針1A對(duì)2.5%人工尿液中檸檬酸的熒光檢測(cè)方法。以380 nm處的熒光猝滅峰為定量依據(jù)，HFS探針1A對(duì)檸檬酸的響應(yīng)在20～120 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.524+0.193lgx，相關(guān)系數(shù)r2=0.992 9，其中，x=lg[citric acid](μmol/L)；y=(IF0-IF)/IF0，IF0和IF分別為與檸檬酸反應(yīng)前后樣品的發(fā)射光強(qiáng)度。此外，利用3倍空白值平均偏差與曲線斜率的比值可得檢出限為1.0 μmol/L?；谠摋l件進(jìn)行了40.0、50.0、60.0 μmol/L的加標(biāo)人工尿液中檸檬酸含量的測(cè)定，回收率為85.7%～92.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～9.2%(表1)。該方法滿足人工尿液中檸檬酸的定量檢測(cè)要求，且HFS探針1A具有定量檢測(cè)尿液中檸檬酸的潛力。

圖4 HFS探針1A的溫度及光照條件(A)， pH值優(yōu)化(B)及抗干擾實(shí)驗(yàn)(C)Fig.4 Optimalization of temperature and UV irradiation(A),pH value(B) and selectivity experiment for HFS probe 1A before and after adding citric acid(C)IFC:fluorescence intensity at 380 nm after addition of citric acid in the blank samples;ccitric acid(A-B):20,1 000 μmol/L;cHFS probe 1A(C):20 μmol/L

2.6 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A對(duì)檸檬酸的響應(yīng)特性及機(jī)理探討

表1 人工尿樣中檸檬酸含量測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Spiked recovery of citric acid in artificial urine(n=3)

HFS探針1A溶液在480 nm處吸收峰的強(qiáng)度隨檸檬酸(CA)濃度的增加而升高(圖5A)，這是因?yàn)镠FS探針1A的螺碳(8號(hào)位，圖2A)在親核型檸檬酸根的進(jìn)攻下，自發(fā)開(kāi)環(huán)成MC態(tài)并與檸檬酸根離子作用形成1A-CA復(fù)合物[11]。這也解釋了HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)后發(fā)生的熒光猝滅現(xiàn)象： HFS探針1A結(jié)合前的SP態(tài)在紫外激發(fā)下能發(fā)出較強(qiáng)熒光，而結(jié)合后1A-CA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度較弱，宏觀上表現(xiàn)為加入檸檬酸后其熒光發(fā)生猝滅。

圖5 HFS探針1A與不同濃度檸檬酸反應(yīng)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖(A)、Job's plot曲線(B)及3種不同結(jié)構(gòu)的螺吡喃化合物對(duì)檸檬酸的響應(yīng)對(duì)比圖(C)Fig.5 UV-visible absorption spectra of HFS probe 1A with different concentrations citric acid(A),Job's curve(B) and probe of 1c,1A and 1f before and after adding citric acid(C)

為了進(jìn)一步考察HFS探針1A與檸檬酸的反應(yīng)比例，繪制了HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)的Job's plot曲線。將HFS探針1A溶液與檸檬酸在室溫下反應(yīng)至平衡，測(cè)定其在380 nm處的熒光強(qiáng)度。由圖5B可見(jiàn)，加入檸檬酸前，[1A]/([1A]+[citric acid])= 1.0，溶液熒光最強(qiáng)；隨著檸檬酸比例增加，該數(shù)值減小，HFS探針1A的熒光強(qiáng)度呈線性下降，當(dāng)[1A]/([1A]+[citric acid])=0.57時(shí)達(dá)到拐點(diǎn)；而[1A]/([1A]+[citric acid])<0.57時(shí)，熒光強(qiáng)度降低的曲線斜率明顯減小。實(shí)驗(yàn)所得兩條Job's plot擬合曲線交點(diǎn)在[1A]/([1A]+[citric acid])=0.57處，即HFS探針1A與檸檬酸的反應(yīng)比例約3∶2。

從HFS探針1A與檸檬酸形成復(fù)合物1A-CA的角度分析，HFS探針1A存在兩個(gè)與檸檬酸作用的位點(diǎn)，分別是8號(hào)缺電子螺碳及30號(hào)吡啶的羥基；而一個(gè)富電子檸檬酸根離子上有3個(gè)可與HFS探針1A相互作用的羧基。由此可見(jiàn)，通過(guò)3分子HFS探針1A與2分子富電子檸檬酸根結(jié)合(圖5C)，可有效促使HFS探針1A從SP態(tài)向MC態(tài)的轉(zhuǎn)變并形成穩(wěn)定的復(fù)合物1A-CA。為進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，制備了兩種與HFS探針1A結(jié)構(gòu)相似的螺吡喃探針1c和1f，并在相同反應(yīng)條件下對(duì)比了3種探針與檸檬酸的反應(yīng)現(xiàn)象。如圖5C所示，當(dāng)40 μmol/L的1c、1f和HFS探針1A分別與2 000 μmol/L的檸檬酸混合加熱后，1c和1f由于與檸檬酸根的離子結(jié)合能力不足，反應(yīng)前后溶液顏色基本無(wú)變化；而HFS探針1A溶液的顏色發(fā)生明顯變化。因此，羥基螯合與螺碳親核加成的協(xié)同作用是促進(jìn)HFS探針1A對(duì)檸檬酸根選擇性響應(yīng)的主要原因。

3 結(jié) 論

本文制備了具有良好水溶性的HFS探針1A，該探針對(duì)檸檬酸根離子有高選擇性響應(yīng)，并伴隨著明顯的顏色變化和熒光猝滅?；诖藱C(jī)制建立了人工尿樣中檸檬酸含量的分析方法，方法線性范圍為20～120 μmol/L，檢出限為1.0 μmol/L；在2.5%人工尿液中檸檬酸的回收率為85.7%～92.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于3.0%～9.2%之間。此外，深入探討了HFS探針1A與檸檬酸的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其高選擇性源于探針螺碳的親核結(jié)合力和羥基螯合作用力的協(xié)同作用。HFS探針1A在尿樣中檸檬酸的可視化檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用潛力。