沒食子酸對(duì)放射性肺損傷大鼠的保護(hù)作用

吳鵬飛 邱立志 張麗麗 白金鳳 滕懷遠(yuǎn) 薛培麗

(四川省科學(xué)城醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，綿陽(yáng)市 621000，電子郵箱：461951469@qq.com)

接受胸部放療的患者中，有50%～100%的患者影像學(xué)表現(xiàn)為肺組織受損，有50%～90%的患者存在亞臨床的肺功能下降，而多達(dá)30%的患者發(fā)生有臨床癥狀的肺損傷。由此可見，放射性肺損傷(radiation-induced lung injury，RILI)已成為胸部放療患者最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重地影響放療效果及患者生存質(zhì)量。然而，目前對(duì)于RILI仍無有效治療措施，因此亟須尋找新的治療手段[1-2]。沒食子酸是一種常見的多酚類化合物，來源廣泛，易于制取，其生物毒性低，半數(shù)致死量高達(dá)5 g/kg[3]。其具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、抗纖維化及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[4]。研究顯示，沒食子酸能抑制PM10導(dǎo)致的大鼠心臟組織局部腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6升高，并能改善心臟射血分?jǐn)?shù)[5]。因此，沒食子酸具有較大的臨床應(yīng)用潛力。目前，有關(guān)沒食子酸改善RILI的研究報(bào)告較為罕見。本研究探討沒食子酸灌胃對(duì)RILI大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)SD大鼠36只[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，批號(hào)：SCXK(chuan)2014-189]，雄性，6周齡，體重200 g左右。6只/籠，自由飲水、攝食，光照節(jié)律12 h/12 h。

1.2 主要試劑 沒食子酸(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%，批號(hào)：S30153)，用0.9%氯化鈉配制成30 mg/mL的工作液；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液(武漢博士德生物公司，批號(hào)：AR1180)；Masson染液(北京索拉寶科技有限公司，批號(hào)：G1340)；大鼠IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)：JL20896；JL12342)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A030-2-1)；兔抗大鼠α 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：19245)；山羊抗兔IgG(上海碧云天公司，批號(hào)：A0208)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及RILI大鼠模型的建立：采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只大鼠分為對(duì)照組、RILI組、RILI+沒食子酸組各12只。RILI組、RILI+沒食子酸組大鼠參照文獻(xiàn)[6]建立RILI模型。4%戊巴比妥(1 mL/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定，照射野上界為兩側(cè)腋窩中點(diǎn)的連線、下界為劍突下緣平面，鉛板遮擋其余部位，6MV-X線直線加速器(美國(guó)Varian公司)單次雙肺照射，劑量20 Gy，源皮距 100 cm，由放療科協(xié)助完成。對(duì)照組不做處理。

1.3.2 干預(yù)方法：從照射后第1天開始，RILI+沒食子酸組給予2 mL 沒食子酸(濃度為30 mg/mL)灌胃，RILI組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，對(duì)照組不做任何處理。灌胃持續(xù)至照射后第28天。在照射后第4周末及第8周末，每組處死6只大鼠，取血清檢測(cè)IL-6、TGF-β1水平；取左肺檢測(cè)肺系數(shù)；取部分右肺組織，固定后行HE染色及Masson-Trichrome 染色，觀察病理改變，并行免疫組化染色觀察α-SMA表達(dá)；部分右肺組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，檢測(cè)羥脯氨酸含量。

1.3.3 肺系數(shù)的檢測(cè)：稱體重后處死大鼠，取左肺，生理鹽水輕柔漂洗，濾紙吸干表面水分，稱重，記為肺濕重，肺系數(shù)=肺濕重(mg)/體重(g)×100，用于評(píng)估肺水腫程度。

1.3.4 肺組織病理學(xué)改變的觀察：取部分右肺組織，4%多聚甲醛加壓固定72 h，行HE染色、Masson-Trichrome染色，觀察病理改變，并采用Szapiel法[7]行肺泡炎評(píng)分及纖維化評(píng)分。

1.3.5 血清IL-6、TGF-β1水平的檢測(cè)：經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3 mL，4℃離心15 min(5 000 r/min)，取上清1 mL，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電公司 ，型號(hào)：51119770DP)檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.3.6 肺組織羥脯氨酸含量的檢測(cè)：-80℃冰箱取出凍存右肺組織，稱取80 mg，按照羥脯氨酸試劑盒說明書操作，堿水法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸含量，用于評(píng)估組織纖維化程度。

1.3.7 肺組織α-SMA表達(dá)水平的檢測(cè)：肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鹽修復(fù)抗原，封閉液封閉，孵一抗，4℃過夜，孵二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素輕染，鏡下觀察肺組織α-SMA表達(dá)強(qiáng)度。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：鏡下可見棕黃色、褐色區(qū)域，則為表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠肺系數(shù)比較 在照射后第4周末、第8周末，與對(duì)照組比較，RILI組及RILI+沒食子酸組大鼠肺系數(shù)均增高，而RILI+沒食子酸組大鼠肺系數(shù)低于RILI組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.2 3組大鼠肺組織病理學(xué)改變 HE染色顯示，對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔未見明顯細(xì)胞滲出；IRLI組大鼠在照射后第4周末可見部分肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，腔內(nèi)見液體滲出，肺泡間隔增寬，細(xì)胞滲出增加，在第8周末肺泡炎性改變有所減輕，部分肺泡阻塞、融合，肺泡間隔增寬更加明顯，部分區(qū)域細(xì)胞成分減少；與RILI組比較，RILI+沒食子酸組大鼠上述病理改變減輕。RILI組第8周末的肺泡炎評(píng)分低于第4周末(t=9.667,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組大鼠肺泡炎評(píng)分均高于對(duì)照組，而RILI+沒食子酸組評(píng)分低于RILI組(均P<0.05)。見圖1和表2。

Masson-Trichrome 染色顯示，對(duì)照組大鼠肺組織未見明顯藍(lán)色膠原纖維沉積；在照射后第4周末，RILI組大鼠在大氣道、大血管附近可見少許藍(lán)色膠原纖維，在第8周時(shí)膠原生成及沉積范圍增加；與RILI組比較，在各時(shí)間點(diǎn)RILI+沒食子酸組大鼠的膠原生成減少。RILI組第8周末的纖維化評(píng)分高于第4周末(t=9.027,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組大鼠纖維化評(píng)分均高于對(duì)照組，而RILI+沒食子酸組評(píng)分低于RILI組(均P<0.05)。見圖2和表2。

圖1 3組大鼠肺組織HE染色(×200)

圖2 3組大鼠肺組織Masson染色(×200)

表2 3組大鼠肺泡炎及纖維化評(píng)分比較(x±s,分)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.3 3組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平比較 與照射后第4周末比較，第8周末RILI組的血清IL-6水平降低(t=16.133，P<0.001)，而TGF-β1水平升高(t=15.790，P<0.001)。在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組血清IL-6及TGF-β1水平均高于對(duì)照組，而RILI+沒食子酸組血清IL-6及TGF-β1水平均低于RILI組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6和TGF-β1水平比較(x±s,pg/mL)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.4 3組大鼠肺組織羥脯氨酸含量比較 RILI組第8周末肺組織中羥脯氨酸含量高于第4周末(t=9.649,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI組與RILI+沒食子酸組肺組織羥脯氨酸含量均高于對(duì)照組，而RILI+沒食子酸組肺組織羥脯氨酸含量低于RILI組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織羥脯氨酸含量比較(x±s,μg/mg)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與RILI組比較，#P<0.05。

2.5 3組大鼠肺組織肌成纖維細(xì)胞激活情況 在照射后第4周末、第8周末，對(duì)照組大鼠肺組織中均未見明顯棕黃色陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域。在照射后第4周末，RILI組肺組織可見α-SMA陽(yáng)性表達(dá)增加，在第8周末陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域明顯增加。在同一時(shí)間點(diǎn)與RILI組比較，RILI+沒食子酸組肺組織α-SMA陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域明顯減少。見圖3。

圖3 3組大鼠肺組織α-SMA表達(dá)水平(免疫組化染色，×200)

3 討 論

沒食子酸化學(xué)名3,4,5，-三羥基苯甲酸，天然存在于綠茶、杧果、葡萄等多種植物內(nèi)。既往研究顯示，沒食子酸具有抗炎、抗纖維化等多種功效。例如，Jin等[8]發(fā)現(xiàn)，沒食子酸可以通過抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)及Smad3磷酸化水平，改善心衰誘導(dǎo)的肺纖維化；Nikbakht等[9]在研究博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予沒食子酸連續(xù)灌胃28 d可以顯著地降低博來霉素導(dǎo)致的血腫瘤壞死因子 α、IL-1β表達(dá)水平。而關(guān)于沒食子酸對(duì)RILI有無保護(hù)作用，目前鮮有研究報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠雙肺進(jìn)行X線照射以建立RILI模型，照射后大鼠的肺系數(shù)、肺泡炎及肺纖維評(píng)分均增高，結(jié)合肺組織病理改變，符合RILI的表現(xiàn)，提示建模成功。我們進(jìn)一步使用沒食子酸灌胃RILI模型大鼠，以觀察沒食子酸的干預(yù)效果。

RILI是由靶細(xì)胞受損后異常修復(fù)、細(xì)胞因子釋放及氧化應(yīng)激等多方面共同參與的復(fù)雜過程，病理上以早期炎癥性改變及后期纖維化為特點(diǎn)[10]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)可以加重肺損傷，促進(jìn)肺纖維化。IL-6、TGF-β1與RILI發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系密切。研究顯示，在RILI動(dòng)物模型及臨床RILI患者中，血IL-6、TGF-β1水平均異常增高，且這兩項(xiàng)指標(biāo)具有預(yù)測(cè)RILI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用[11]。IL-6可刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞激活，從而間接增強(qiáng)TGF-β1的促炎、促纖維化能力[6]。TGF-β1能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化并表達(dá)α-SMA，并刺激膠原與纖維結(jié)合素生成，導(dǎo)致異常的、大量的細(xì)胞外基質(zhì)蓄積。在RILI早期，TGF-β1水平即明顯升高，纖維化后期階段仍持續(xù)高表達(dá)，具有很強(qiáng)的促纖維化能力[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在照射后第4周末，RILI組大鼠血清IL-6、TGF-β1水平明顯升高，且第8周末TGF-β1水平繼續(xù)增高；而經(jīng)過沒食子酸處理后，RILI+沒食子酸組大鼠血IL-6、TGF-β1水平以及肺泡炎及肺纖維評(píng)分均低于RILI組，肺組織HE染色及Masson染色顯示肺組織早期炎癥反應(yīng)及后期纖維化均明顯改善。這表明沒食子酸能夠抑制RILI大鼠全身及局部炎癥反應(yīng)，改善肺組織的纖維化，從而發(fā)揮肺保護(hù)作用。

激活的成纖維細(xì)胞可以“正反饋”刺激成纖維細(xì)胞活化，促進(jìn)TGF-β1等炎性分子分泌，及基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子失衡，使得細(xì)胞外基質(zhì)大量生成[13]。而α-SMA表達(dá)增加是成纖維細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志，抑制α-SMA表達(dá)可減少成纖維細(xì)胞的激活，從而減輕纖維化。Yue等[14]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)照射后豬肺組織中α-SMA表達(dá)增加，纖維化程度加重。Cao等[15]發(fā)現(xiàn)，虎杖苷能顯著地抑制RILI小鼠肺組織中α-SMA的表達(dá)，從而減少膠原蛋白沉積。羥脯氨酸在膠原蛋白中特異性表達(dá)，因此檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸含量可推測(cè)肺纖維化的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在照射后第4周末，RILI組肺組織的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)及羥脯氨酸含量均增加，在第8周末進(jìn)一步增加；而經(jīng)沒食子酸灌胃后，RILI+沒食子酸組肺組織α-SMA陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域明顯減少，羥脯氨酸含量降低。這提示沒食子酸或通過抑制RILI大鼠肺組織中α-SMA的表達(dá)以及減少羥脯氨酸生成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述，沒食子酸對(duì)RILI大鼠具有肺保護(hù)作用，而這可能是通過減輕炎癥反應(yīng)、抑制成纖維細(xì)胞激活實(shí)現(xiàn)的，其具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。