頂空-氣相色譜法快速測(cè)定食品中甜蜜素的含量

何 浩，吳海智，唐吉旺，朱 禮，袁列江

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙410007)

甜蜜素，其化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是食品生產(chǎn)中常用的甜味劑，其甜度是蔗糖的30～40倍。消費(fèi)者如果經(jīng)常食用甜蜜素含量超標(biāo)的食品，就會(huì)對(duì)人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害[1]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760－2014規(guī)定，甜蜜素在餅干、果凍、飲料類中最大使用量為0.65 g·kg－1，在腌制的蔬菜中最大使用量為1.0 g·kg－1，在面包、糕點(diǎn)中最大使用量為1.6 g·kg－1，在涼果類、話化類中最大使用量為8.0 g·kg－1。

食用檳榔作為湖南、海南等地的地方性特色食品，湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 43/132－2004和海南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB46/T 75－2007中均明確規(guī)定其甜蜜素含量限值為8.0 g·kg－1。

目前，食品中甜蜜素的測(cè)定方法有自動(dòng)液體進(jìn)樣-氣相色譜法[2]、頂空-氣相色譜法[3-5]、比色法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-8]、液相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]和離子色譜法[11]等。

液體進(jìn)樣-氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法需要冰浴衍生化反應(yīng)等較繁瑣的步驟，且衍生化產(chǎn)物為環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇的混合物，隨著時(shí)間的推移，環(huán)己醇亞硝酸酯會(huì)逐步轉(zhuǎn)化為環(huán)己醇，對(duì)定量造成影響。比色法的檢出限較高，不適用于微量甜蜜素的測(cè)定。液相色譜法也需經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)和液液萃取等步驟，且液相色譜法分離度比氣相色譜法差，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜法的前處理簡(jiǎn)單，但只適合于白酒等基質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品，且該儀器昂貴，不利于方法的普及。離子色譜法對(duì)基質(zhì)的除雜要求較高，過(guò)程繁瑣，且容易造成回收率偏低。因此，找到一種前處理簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確并適用于各種復(fù)雜食品基質(zhì)的測(cè)定甜蜜素含量的方法是非常有必要的。本工作對(duì)樣品前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行定性，并推斷反應(yīng)的機(jī)理;以甜蜜素的主要衍生化產(chǎn)物環(huán)己烯為目標(biāo)待測(cè)物，建立了頂空-氣相色譜法測(cè)定食品中甜蜜素含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HSS86.50 Plus型頂空進(jìn)樣器;GC 2010Plus型氣相色譜儀，配火焰離子化檢測(cè)器(FID);SPB-3型全自動(dòng)空氣源;SPH-300 型空氣發(fā)生器;7697A-7890A-5975C 型 頂 空-氣 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀，配NIST 11譜庫(kù);ATY224型電子天平;KQ-500VDV型超聲波清洗器;DC 2020型低溫恒溫槽。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取0.100 0 g甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入50 m L水，超聲溶解后，移入100 m L 棕色容量瓶中，定容搖勻，配制成1.000 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取25.0 m L 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至250 m L 棕色容量瓶中，用水定容，搖勻，配制成100 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.1%，亞硝酸鈉和硫酸均為分析純;高純氮?dú)饧兌炔恍∮?9.999%，高純氦氣純度不小于99.999%;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)頂空條件 加熱箱溫度50 ℃;定量環(huán)溫度55 ℃;傳輸線溫度60 ℃;循環(huán)時(shí)間13.0 min;平衡時(shí)間30 min;定量閥體積1.0 m L。

2)氣相色譜條件 DB-1 石英毛細(xì)管色譜柱(15.0 m×0.53 mm，0.50 μm)，色 譜 柱 流 量1.99 m L·min－1;氣 化 室 溫 度150 ℃，F(xiàn)ID 溫 度300 ℃;載氣為氮?dú)?氫氣流量40.0 m L·min－1，空氣流量400.0 m L·min－1，尾吹氣流量30.0 m L·min－1;分流進(jìn)樣，分流比為20∶1。柱升溫程序:初始溫度為80 ℃，保持1 min;以40 ℃·min－1速率升溫至100 ℃，保持2 min;再以40 ℃·min－1速率升溫至200 ℃，保持2 min，共8 min。

3)氣相色譜-質(zhì)譜條件 DB-5MS石英毛細(xì)管柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm);色 譜 柱 流 量1.0 m L·min－1;氣化室溫度150 ℃;載氣為氦氣;分流進(jìn)樣，分流比為100∶1。柱升溫程序:初始溫度為80 ℃，保持1 min;以25 ℃·min－1速率升溫至155 ℃，保持6 min，共10 min。電子轟擊離子源(EI)，EI 能 量70 e V;氣 相 色 譜-質(zhì) 譜 接 口 溫 度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四 極 桿 溫 度150 ℃;溶劑延遲時(shí)間0 min;掃描方式為全掃描;掃描質(zhì)荷比m/z30～250。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎均勻的固體樣品或液體樣品(包括含酒精的飲料)10.000 0 g，放入100 m L 帶刻度的比色管中，加水至90 m L，固體樣品超聲提取1 h，含二氧化碳液體樣品超聲提取10 min，冷卻后用水定容，搖勻。涼果類、話化類食品和食用檳榔的提取液需稀釋20倍后才可使用，其他樣品提取液均可直接使用。移取10.0 m L 樣品提取液至20 m L 頂空進(jìn)樣瓶中，再依次加入100 g·L－1硫酸溶液1.0 m L和100 g·L－1亞硝酸鈉溶液1.0 m L，封蓋后振蕩搖勻，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)方法探究

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97－2016第一法規(guī)定了測(cè)定甜蜜素的方法:甜蜜素在硫酸介質(zhì)中與亞硝酸發(fā)生反應(yīng)，利用反應(yīng)生成的環(huán)己醇亞硝酸酯進(jìn)行氣相色譜定性和定量分析;由于此方法衍生化過(guò)程中加入了氯化鈉，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物較為復(fù)雜，此時(shí)氯化鈉不再發(fā)揮鹽析作用，而是作為反應(yīng)物生成了各種氯代產(chǎn)物，如氯代環(huán)己烷、2-氯環(huán)己醇、順式1，2-二氯環(huán)己醇、反式1，2-二氯環(huán)己醇等[12]。文獻(xiàn)[7]采用頂空-氣相色譜法研究了甜蜜素，并將其作為定量物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，NIST11 檢索庫(kù)中無(wú)該物質(zhì)信息。本工作在上述工作基礎(chǔ)上，在亞硝酸鹽的冷溶液中加入強(qiáng)酸，生成的亞硝酸與環(huán)己基氨基磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，期望利用其生成環(huán)己烯[13]對(duì)甜蜜素進(jìn)行頂空-氣相色譜法定量分析。

2.2 色譜行為

將甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品按試驗(yàn)方法進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的色譜圖見(jiàn)圖1，通過(guò)和空白樣品色譜圖比較得出，甜蜜素衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間為1.73 min。取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品衍生后溶液，在氣相色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，所得質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。將該質(zhì)譜圖與NIST11 譜庫(kù)比對(duì)，確定該衍生產(chǎn)物為環(huán)己烯，其保留時(shí)間為1.64 min。

圖1 甜蜜素衍生物的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of cyclamate derivative

圖2 甜蜜素衍生物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of cyclamate derivative

2.3 提取方法的選擇

試驗(yàn)分別采用超聲、煮沸兩種方式對(duì)樣品進(jìn)行了提取。超聲提取步驟見(jiàn)試驗(yàn)方法;煮沸提取是將裝有樣品的比色管放入100℃水浴鍋中加熱1 h，其他步驟同超聲提取方法的一致。兩種方法的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知:超聲提取與煮沸提取結(jié)果無(wú)顯著差異，但得考慮前者的操作更便捷，試驗(yàn)采用超聲提取方法。

2.4 頂空平衡條件的選擇

平衡時(shí)間的選擇，既要保證目標(biāo)物質(zhì)能從液相中充分逸散到氣相中，又要避免目標(biāo)物質(zhì)的分解和反應(yīng)導(dǎo)致的目標(biāo)產(chǎn)物含量降低。試驗(yàn)選擇在50 ℃下 平 衡5，10，20，30，42，54，66，78，90，102，114，126，138，180，210，240，300 min后進(jìn)樣，結(jié)果表明:環(huán)己烯峰面積隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步下降趨勢(shì)，且100 min后峰面積已減小到原來(lái)的80%，為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)保證樣品在重氮化反應(yīng)后100 min內(nèi)完成測(cè)定。試驗(yàn)選擇頂空平衡時(shí)間為30 min。

表1 超聲提取與煮沸提取結(jié)果對(duì)比(n＝6)Tab.1 Comparison of results obtained by ultrasonic extraction and boiling extraction(n＝6)

同時(shí)，當(dāng)頂空進(jìn)樣器和氣相色譜連續(xù)進(jìn)樣50次以上未維護(hù)時(shí)，環(huán)己烯的峰形變差，響應(yīng)值下降明顯。應(yīng)在連續(xù)進(jìn)樣30次后，將頂空進(jìn)樣器的爐子、定量環(huán)和傳輸線在130 ℃老化1 h以上，將色譜柱在最高耐受溫度下老化0.5～1 h，以保證定量結(jié)果的重現(xiàn)性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

分別向5個(gè)頂空瓶中加入100 mg·L－1甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m L，用水定容至10.0 m L，按試驗(yàn)方法在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品取樣量(mg)為橫坐標(biāo)，以環(huán)己烯峰面積(μV·s－1)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品取樣量在0.000 01～5 mg內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝4.074×105x＋2.492×104，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

加入0.000 1 mg甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，按試驗(yàn)方法重復(fù)測(cè)定12次，以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限(3S/N)為0.4 mg·kg－1，以10倍信噪比計(jì)算方法測(cè)定下限(10S/N)為1.3 mg·kg－1，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97－2016第一法中甜蜜素檢出限為10 mg·kg－1，本方法檢出限比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的低。這是因?yàn)轫斂辗ㄖ协h(huán)己烯主要集中在頂空瓶上方10 m L的空間，而定量閥體積為1.0 m L，相當(dāng)于千分之一的環(huán)己烯進(jìn)入氣相色譜儀;在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97－2016第一法中，提取溶劑正己烷體積為10.0 m L，進(jìn)樣量?jī)H1.0μL，相當(dāng)于萬(wàn)分之一進(jìn)入氣相色譜儀。因此，本法比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限低。除此之外，本方法還可以通過(guò)降低分流比進(jìn)一步降低檢出限。

2.6 回收試驗(yàn)

分別對(duì)雪碧樣品和雞蛋卷樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的6次平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2?；厥章史蠂?guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》附錄F要求。

表2 本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法回收率比對(duì)(n＝6)Tab.2 Comparison of recovery of this method and national standard method(n＝6)

2.7 方法比對(duì)

采用本方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97－2016第一法分別對(duì)雞蛋卷等9種不同樣品進(jìn)行分析，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3。兩種方法相對(duì)偏差的絕對(duì)值均小于4.0%，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。

表3 本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比(n＝6)Tab.3 Comparison of results of this method and national standard method(n＝6)

本工作采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)甜蜜素衍生化產(chǎn)物進(jìn)行定性，確定該衍生化產(chǎn)物為環(huán)己烯。并在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97－2016第一法基礎(chǔ)上優(yōu)化了前處理步驟，分析了甜蜜素衍生物峰面積與樣品平衡時(shí)間的關(guān)系曲線，得到樣品的最優(yōu)平衡時(shí)間為30 min。建立了頂空-氣相色譜法測(cè)定食品中甜蜜素含量的方法。本方法的檢出限和回收率均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》附錄F要求。