QuEChERS提取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量

杭學(xué)宇，吳珺瑋，宋 鑫，王 芹，馮曉青，王 露，徐 瑞，王丹丹，陸 娟

(1.淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安223001; 2.南通市疾病預(yù)防控制中心，南通226007)

農(nóng)藥對(duì)于提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量、預(yù)防病蟲害具有重要的作用，常用的農(nóng)藥包括有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類等4大類。其中，氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有殺滅鱗翅目和鞘翅目害蟲的作用，同時(shí)具有作用快、適用范圍廣、穩(wěn)定性低且易水解等特性[1]，在蔬菜種植中得到了廣泛應(yīng)用。生產(chǎn)過程中，由于缺乏對(duì)蔬菜種植過程中農(nóng)藥使用的監(jiān)管，菜農(nóng)為提高蔬菜產(chǎn)量盲目大量使用氨基甲酸酯類農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量超標(biāo)。氨基甲酸酯類化合物安全性的研究表明，氨基甲酸酯作為膽堿酯酶抑制劑，具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性[2]，已有氨基甲酸酯化合物引起慢性中毒的報(bào)道[3]。建立高效的測(cè)定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的分析方法，對(duì)確保蔬菜農(nóng)藥殘留量符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，以及提高蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量、保障環(huán)境安全和人類生命健康具有十分重要的意義。

測(cè)定蔬菜中農(nóng)藥殘留量的傳統(tǒng)前處理方法主要有基質(zhì)固相分散法(MSPD)[4]、液-液萃取法(LLE)[5]、凝膠滲透色譜法(GPC)[6-7]等，這些方法均有制備步驟繁瑣，消耗時(shí)間長，易造成目標(biāo)分析物損失等缺點(diǎn)。QuECh ERS提取具有操作簡單、提取效率高和試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[8]，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、真菌毒素和三環(huán)唑等化合物的測(cè)定過程中[9-10]，但仍存在凈化效果差和回收率較低等問題[11]。

本工作采用Qu ECh ERS對(duì)蔬菜中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行提取，結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)所用固定相的組成進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對(duì)市場(chǎng)常見的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量進(jìn)行測(cè)定，可為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 型超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀;FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿器;TGL-16 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);Vortex Geniez型渦旋振蕩器;AR 2130型電子天平;TECHNE 型氮吹儀;HZQ/THZ型振蕩器;MUL 9000(B)-H-20型純水機(jī)。

6 種氨基甲酸酯化合物的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑;乙腈為色譜純;甲酸為優(yōu)級(jí)純;無水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純;試驗(yàn)用水為高純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(75 mm×2.1 mm，2.7μm);進(jìn)樣量為5μL;柱溫為35 ℃;流量為0.3 m L·min－1;流動(dòng)相A 為含0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子噴射電壓為4 000 V;輔助干燥氣壓力為241.33 kPa，霧化氣壓力為275.80 k Pa，氣簾氣壓力為206.85 k Pa;入口電壓為10 V;離子源溫度為600 ℃;駐留時(shí)間為100 ms。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“?”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

取淮安各縣、區(qū)的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜樣品適量，搗碎充分混勻后放入高速電動(dòng)勻漿器中粉碎，于－20 ℃條件下保存待用。

稱取10.00 g樣品，加入含1.3%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液的乙腈10 m L，渦旋混勻后，超聲提取20 min。加入8.2 g無水硫酸鈉和3.0 g氯化鈉，渦旋后，以5 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于雞心瓶中，用10 m L 的含1.3%甲酸溶液的乙腈重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相，移取2.0 m L 有機(jī)相加入優(yōu)化的QuEChERS 凈化管中(內(nèi)含有PSA 0.4 g、C180.25 g和GCB 8.2 mg)，渦旋振蕩2 min，以5 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心2 min，取上清液經(jīng)過0.22μm 有機(jī)濾膜過濾，得到待測(cè)溶液，按照儀器工作條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)10μg·kg－1的6種氨基甲酸酯類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。

2.2 QuECh ERS前處理?xiàng)l件的選擇

Qu ECh ERS前處理過程是液-液萃取和基質(zhì)分散固相萃取的結(jié)合，試驗(yàn)對(duì)液-液萃取過程中的提取溶劑和鹽析劑進(jìn)行了考察，同時(shí)對(duì)基質(zhì)分散固相萃取過程中的吸附劑種類和用量進(jìn)行了考察。

圖1 6種氨基甲酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of the 6 carbamate compounds

試驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑，但是氨基甲酸酯農(nóng)藥極性較大，且在堿性條件下易分解，試驗(yàn)采用正離子掃描模式，加入適量的甲酸有利于氨基甲酸酯類化合物的離子化，從而提高靈敏度，但加入過量的甲酸會(huì)抑制氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)子化，降低靈敏度[12]。試驗(yàn)考察了在乙腈中分別加入0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、1%甲酸溶液和2%甲酸溶液時(shí)對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的提取溶劑對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recovery of the 6 carbamate compounds

由圖2 可知:隨著甲酸溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率逐漸增大;當(dāng)甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率達(dá)到較大值;繼續(xù)增大甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇的提取溶劑為1%甲酸-乙腈溶液。

Qu ECh ERS方法中常用的鹽析劑為氯化鈉，試驗(yàn)考察了氯化鈉的用量分別為0.5，2.0，3.5，5.0 g時(shí)對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明:隨著氯化鈉用量的增大，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率逐漸增大;當(dāng)氯化鈉用量為2.0 g時(shí)，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率較好;繼續(xù)增加氯化鈉用量，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇的鹽析劑為2.0 g的氯化鈉。

圖3 氯化鈉用量對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.3 Effect of amount of the sodium chloride on recovery of 6 carbamate compounds

應(yīng)用QuECh ERS對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行前處理過程中，經(jīng)常使用的吸附劑為PSA 和C18。PSA 吸附劑對(duì)脂肪酸結(jié)構(gòu)化合物具有較強(qiáng)的吸附作用，C18吸附劑可以去除非極性化合物，但是PSA吸附劑和C18吸附劑去除色素能力的較弱。由于蔬菜中含有大量的色素，試驗(yàn)選擇加入GCB吸附劑去除蔬菜提取液中的色素，降低基質(zhì)噪聲，提高檢測(cè)靈敏度。以扁豆為研究對(duì)象，在樣品溶液中加入0.4 g PSA 吸附劑和0.25 g C18吸附劑，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以1%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑，加入2.0 g氯化鈉，試驗(yàn)考察了GCB的用量分別為5，10，30，40，50 mg時(shí)對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 GCB吸附劑的用量對(duì)6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.4 Effect of amount of GCB adsorbent on recovery of the 6 carbamate compounds

由圖4可知:GCB吸附劑的用量增加至30 mg時(shí)，6種氨基甲酸酯的回收率均達(dá)到較大值;繼續(xù)增加GCB 吸附劑的用量，克百威、3-羥基克百威的回收率反而下降。這可能是因?yàn)镚CB 吸附劑對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的化合物有親和性，在去除葉綠素、甾醇、兒茶素和維生素等雜質(zhì)的同時(shí)，對(duì)具有芳香環(huán)平面結(jié)構(gòu)的克百威、3-羥基克百威也有較強(qiáng)的吸附作用。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)

本工作在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6 試 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 軟 件，通 過Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，將甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)、氯化鈉用量、GCB用量作為變量因素，分別記為A、B 和C，氨基甲酸酯的回收率作為應(yīng)變量，記為y，Box-Behnken設(shè)計(jì)的顯著性因素水平見表3。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重回歸分析，數(shù)據(jù)與二階多項(xiàng)式方程相擬合，擬合方程為y＝－3.33A2－2.63B2－1.98C2－0.20AC＋1.40A ＋0.55B－3.35C＋83.36。

表3 顯著性因素水平Tab.3 Significance factor level

采用方差分析(ANOVA)對(duì)該模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，該二次多元回歸模型具有顯著性意義(p＜0.01)，失擬項(xiàng)為不顯著，確定系數(shù)為0.986 0，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)期匹配度為98.6%，校正確定系數(shù)為0.968 0，表明該模型可解釋96.8%的變化效應(yīng)，本模型可應(yīng)用于實(shí)際分析。

響應(yīng)面圖可直觀地反應(yīng)作為各因素交互項(xiàng)作用下的氨基甲酸酯類化合物的提取效果，結(jié)果見圖5。

圖5 氨基甲酸酯類純化試驗(yàn)響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of carbamate purification test

由圖5可知:甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)由0.1%增大至1.0%時(shí)，氨基甲酸酯類化合物的回收率呈增大趨勢(shì)，這可能是由于氨基甲酸酯類在堿性條件下易分解，降低p H 有利于對(duì)其進(jìn)行提取;隨著甲酸溶液的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大，氨基甲酸酯類化合物的回收率沒有顯著性變化。氯化鈉質(zhì)量在2.8 g 左右時(shí)，氨基甲酸酯類提取率最高，這可能是因?yàn)槁然c增強(qiáng)溶液的離子效應(yīng)，促進(jìn)分層提高氨基甲酸酯類化合物的提取效率。GCB的添加量對(duì)涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威和涕滅威的提取效果無明顯影響，而GCB用量達(dá)到32 mg后，其他幾種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率均顯著性降低。根據(jù)構(gòu)建的模型計(jì)算得到最佳提取凈化條件為:含1.3%甲酸溶液的乙腈、3.0 g氯化鈉和8.2 mg GCB，預(yù)計(jì)回收率為85.0%。在最優(yōu)條件下進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，6 種氨基甲酸酯農(nóng)藥的回收率為80%～105%，平均回收率為84.7%。優(yōu)化的Qu ECh ERS法不僅可以去除雜質(zhì)減少基質(zhì)干擾，還能夠滿足農(nóng)殘檢測(cè)回收率的要求。

2.4 工作曲線、檢出限和測(cè)定下限

分別向8份陰性扁豆樣品提取液中加入6種氨基甲酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配制0.200～100μg·L－1的工作溶液系列，按照儀器工作條件對(duì)其測(cè)定，以6種氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，6種氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度均在0.200～100μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出 限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見表4。

表4 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

分別向陰性扁豆樣品基質(zhì)溶液中添加1，50，100μg·L－1的6種氨基甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結(jié)果表明:6種氨基甲酸酯類化合物的回收率為81.0%～111%，RSD 為2.8%～4.9%，說明該方法具有良好的精密度。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)茼蒿、韭菜和扁豆等10份樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:在6個(gè)樣品中均檢出了氨基甲酸酯類化合物;1號(hào)茼蒿樣品中檢出涕滅威砜和克百威的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.77，1.86μg·kg－1;3號(hào)茼蒿樣品中檢出3-羥基克百威的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.08μg·kg－1;4號(hào)韭菜樣品中檢出涕滅威亞砜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.53μg·kg－1;7號(hào)扁豆樣品中檢出克百威的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.93μg·kg－1;8號(hào)扁豆樣品中檢出涕滅威的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.27μg·kg－1;9號(hào)扁豆樣品中檢出克百威的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.19μg·kg－1。本工作建立了Qu ECh ERS對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合UPLC-MS/MS測(cè)定其中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析方法。方法操作過程簡單、快速，靈敏度高，能滿足國內(nèi)外氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析測(cè)定的要求。