高效液相色譜法結合一測多評法對隔山消發(fā)酵前后3種苯乙酮類化合物含量變化的分析

楊 玲，向家俊，李齊激，楊 艷，廖 秀，楊小生，楊 娟?

(1.貴州大學 藥學院，貴陽550025； 2.貴州醫(yī)科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽550014；3.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴陽550014)

隔山消系蘿藦科植物牛皮消或白首烏的塊根，其味甘、苦，性微溫，廣布于四川、貴州、云南等地。隔山消具有消食化積、養(yǎng)陰補虛、抗衰老、補血提氣、補血生乳、消水退腫等功效，臨床上用于治療虛損勞傷、腹痛腹脹、急慢性脅痛、腹水、腰腿疼痛以及血虛乳少等癥狀[1-2]。隔山消的化學成分主要有苯乙酮類、甾體苷類、香豆素類、木脂素類、有機酸類等，其中所含C21甾體皂苷和苯乙酮類是其抗腫瘤與抗免疫的主要活性成分[3-4]。雖然該藥材未列入食品使用序列，但民間有悠久的食用歷史，《本草綱目》、《天寶本草》、《陜西中草藥》、《貴陽民間藥材》等著作均有記載其食療方劑[5]。

我國早在一千多年前就已將微生物發(fā)酵的方法應用于中藥炮制當中，是最早利用微生物轉(zhuǎn)化天然藥物的國家[6]。作為藥品和食品的傳統(tǒng)加工方法，微生物發(fā)酵一直被我國人民沿用至今，通過發(fā)酵使其功能性成分得到進一步優(yōu)化，或增效，或減毒[7-9]。在對隔山消發(fā)酵液中功效成分的前期研究中，發(fā)現(xiàn)苯乙酮類成分的含量對隔山消免疫活性具有一定的影響[10]，為更好地評價隔山消發(fā)酵前后苯乙酮類成分的含量，本工作采用高效液相色譜法結合一測多評法(QAMS)建立同時測定隔山消和隔山消發(fā)酵液中2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮等3種苯乙酮類化合物的方法，以2，4-二羥基苯乙酮為參照物，計算2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮的相對校正因子，進而計算其含量，并與外標法測得結果進行比較，為進一步建立隔山消發(fā)酵液質(zhì)量評價方法提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵、在線脫氣機、自動控溫自動進樣、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)、色譜工作站；KQ-3000 型數(shù)控超聲波清潔器；BIC-400型人工氣候箱。

3種苯乙酮類化合物的混合標準儲備溶液:含0.48 g·L－12，4-二羥基苯乙酮、0.24 g·L－12，5-二羥基苯乙酮、0.32 g·L－1白首烏二苯酮，稱取適量的2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮對照品，置于10 m L 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。

乙腈、甲醇均為色譜純，試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫30 ℃；流量1.0 m L·min－1；進樣量10μL；測定波長265 nm。流動相:A 為水，B為乙腈，C 為甲醇。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 試驗方法

1.3.1 隔山消發(fā)酵液的制備

隔山消藥材于2017年9月采自貴州清鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為蘿藦科植物牛皮消的塊根。

稱取100.0 g隔山消樣品，加入6倍質(zhì)量的水，粉碎制成勻漿，再添加10.0 g蔗糖、0.5 g高效酒曲，密封稱重，25 ℃發(fā)酵14 d，稱重，加水補足減失質(zhì)量，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得隔山消發(fā)酵液。

1.3.2 隔山消樣品溶液的制備

稱取100.0 g隔山消樣品，加入6倍質(zhì)量的水，粉碎制成勻漿，再添加10.0 g蔗糖，密封稱重，25 ℃浸泡14 d，稱重，加水補足減失質(zhì)量，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得隔山消樣品溶液。

1.3.3 空白溶液的制備

稱取1.0 g蔗糖、0.5 g高效酒曲置于錐形瓶中，再加入6 m L水，密封稱重，25℃浸泡14 d，稱重，加水補足減失質(zhì)量，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得空白溶液。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對隔山消發(fā)酵液、隔山消樣品溶液、3種苯乙酮類化合物的混合標準溶液和空白溶液進行測定，其色譜圖見圖1。

由圖1可知:2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮的分離度較好。

2.2 測定波長的選擇

按色譜條件采用DAD 對3種苯乙酮類化合物的混合標準溶液進行測定，在波長190～400 nm 內(nèi)對2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮進行紫外全波長掃描。結果表明:2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮的最大吸收波長均為265 nm 左右。試驗選擇測定波長為265 nm。

2.3 標準曲線和檢出限

分別移取3種苯乙酮類化合物的混合標準儲備溶 液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 m L 置 于6個2 m L容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為3種苯乙酮類化合物的混合標準溶液系列。按色譜條件對上述混合標準溶液系列進行測定，以3種苯乙酮類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線。3種苯乙酮類化合物的線性范圍、線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。

以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)[11-12]，結果見表2。

2.4 精密度試驗

按色譜條件對3種苯乙酮類化合物的混合標準溶液(含0.24 g·L－12，4-二羥基苯乙酮、0.12 g·L－12，5-二羥基苯乙酮、0.16 g·L－1白首烏二苯酮)連續(xù)測定6次，計算2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮峰面積的相對標準偏差(RSD)依次為1.5%，1.5%，1.1%。

按試驗方法制得同一批的12份隔山消樣品的樣品溶液和發(fā)酵液，并按色譜條件進行測定。結果表明:樣品溶液中2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮測定值的RSD 依次為0.30%，0.34%，0.42%；發(fā)酵液中2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮測定值的RSD依次為0.24%，0.80%，0.38%。

圖1 隔山消發(fā)酵液、隔山消樣品溶液、3種苯乙酮類化合物的混合標準溶液和空白溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of fermentation broth of Cynanchum bungei Decne，solution of Cynanchum bungei Decne sample，mixed standard solution of 3 acetophenone compounds and blank solution

表2 線性范圍、線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.5 回收試驗

選取已知含量的12份隔山消粉末樣品，按試驗方法制得樣品溶液和發(fā)酵液，并按色譜條件進行加標回收試驗。

回收試驗結果見表3。

表3 回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

2.6 相對校正因子和相對保留時間的測定

分別移取3 種苯乙酮類化合物的混合標準溶液，以不同進樣體積注入色譜儀，按色譜條件測定色譜峰面積和保留時間，以2，4-二羥基苯乙酮為參照物，計算2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮的相對校正因子和相對保留時間，結果見表4。

表4 相對校正因子和相對保留時間Tab.4 Relative correction factors and relative retention time

由表4可知:不同進樣體積時，2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮相對于2，4-二羥基苯乙酮的相對校正因子和相對保留時間基本相同。

試驗考察了在一測多評法的建立過程中，2，4-二羥基苯乙酮對2，5-二羥基苯乙酮和白首烏二苯酮的相對校正因子和相對保留時間的重現(xiàn)性。結果表明:各相對校正因子和相對保留時間的重現(xiàn)性均較好。

2.7 外標法與一測多評法的比較

選取同一批隔山消樣品12份，按試驗方法制得樣品溶液和發(fā)酵液，并按色譜條件分別采用外標法和一測多評法計算3種苯乙酮類化合物的含量，一測多評法以2，4-二羥基苯乙酮為參照物，一測多評法結果和外標法結果的Pearson相關系數(shù)，見表5。

表5 外標法結果和一測多評法結果的比較(n＝6)Tab.5 Comparison of the results of external standard method and QAMS(n＝6)

由表5可知:一測多評法結果和外標法結果相似性極高。一測多評法在隔山消樣品溶液和隔山消發(fā)酵液中3種苯乙酮類化合物質(zhì)量評價中的應用是可行的。

2.8 隔山消發(fā)酵前后3種苯乙酮類化合物的含量變化

選取同一批隔山消樣品12份，按試驗方法制得樣品溶液(6份)和發(fā)酵液(6份)，采用一測多評法計算3種苯乙酮類化合物的含量，結果見表6。

由表6可知:隔山消發(fā)酵液中2，4-二羥基苯乙酮和2，5-二羥基苯乙酮含量高于原藥材中2，4-二羥基苯乙酮和2，5-二羥基苯乙酮含量，隔山消發(fā)酵液中白首烏二苯酮含量低于原藥材中白首烏二苯酮含量。

表6 隔山消樣品發(fā)酵前后3種苯乙酮類化合物的含量(n＝6)Tab.6 Content of 3 acetophenone compounds before and after fermentation of Cynanchum bungei Decne sample(n＝6) mg·g－1

與原藥材相比，發(fā)酵液中2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮含量較高，白首烏二苯酮含量較低。用甲醇對發(fā)酵藥渣進行提取，計算發(fā)酵藥渣中的3種苯乙酮類化合物的含量，與發(fā)酵液中3種苯乙酮類化合物的含量進行累計。與原藥材相比，發(fā)酵藥渣和發(fā)酵液中白首烏二苯酮的總量基本一致，2，4-二羥基苯乙酮總量和2，5-二羥基苯乙酮總量均略有升高。文獻[13-15]報道丹皮酚通過微生物轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基苯乙酮，該成分也存在于隔山消中。試驗利用高效酒曲對丹皮酚進行發(fā)酵，結果表明，高效酒曲能成功轉(zhuǎn)化丹皮酚得到2，4-二羥基苯乙酮。未見通過微生物轉(zhuǎn)化得到2，5-二羥基苯乙酮的報道。