張王鋒 尹建威

榆林市第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科719000

通信作者：尹建威,Email:jw000000000@163.com

目前,肺癌已經(jīng)成為全球癌癥的首要死因,而非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的85%。NSCLC患者早期沒有明顯的臨床癥狀,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,患者疾病已經(jīng)發(fā)展到中晚期,嚴重影響患者的生存期[1]。早診斷對于NSCLC 的治療至關(guān)重要。因此,尋找NSCLC的早期生物標(biāo)志物已經(jīng)成為研究的重點和熱點[2]。細胞外囊泡是一種納米級別的微顆粒,由細胞分泌并帶有相應(yīng)來源細胞生物遺傳信息,可以在所有體液中穩(wěn)定存在[3]。最新研究表明細胞外囊泡特異性地包含多種微小RNA (microRNA,miRNA),可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物[4]。研究表明miR-191在多種腫瘤存在不同程度的表達異常[5]。為了探討外周血細胞外囊泡miR-191 表達水平在早期NSCLC 中的診斷價值,本研究對50例早期NSCLC患者進行研究,現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容報道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2018年1～12月榆林市第二醫(yī)院收治的60 例早期NSCLC 患者作為觀察組,所有患者經(jīng)病理診斷確診為NSCLC。入組標(biāo)準：(1)既往無腫瘤相關(guān)疾病;(2)未接受過放化療;(3)TNM 分期為Ⅰ和Ⅱ期患者。排除標(biāo)準： (1)妊娠、感染患者;(2)合并有肝腎功能不全、糖尿病的患者;(3)合并有心腦血管疾病的患者;(4)合并有其他腫瘤的患者。選取同期體檢的年齡和性別匹配的60名健康者作為對照組,本研究通過榆林市第二醫(yī)院倫理委員會批準 (20200089),所有患者及其家屬知情后簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所有患者于入院后治療前第2天清晨采集EDTA-K2抗凝血液標(biāo)本。離心后提取血清血漿,-80 ℃保存?zhèn)溆?。將所有患者的血漿標(biāo)本室溫溶解后,3 000×g,4 ℃離心15 min,以去除血漿中雜質(zhì),轉(zhuǎn)移上清液到新EP管中,采用液壓透析濾過法收集細胞外囊泡,并進行分離和富集,將提取的細胞外囊泡進行考馬斯亮藍蛋白定量后備用。

吸取分離純化后的細胞外囊泡懸液加于載樣銅網(wǎng)上,待網(wǎng)孔吸收干燥后,加入洗液洗滌,然后加入電鏡溶液,反應(yīng)10 min,并洗滌2 次,室溫下干燥過夜,電鏡下成像。并根據(jù)考馬斯亮藍蛋白定量結(jié)果取10μg細胞外囊泡,按照1∶1 000的比例用PBS稀釋,然后采用納米示蹤技術(shù)統(tǒng)計細胞外囊泡的粒徑和濃度。

分別采用RNA 提取試劑盒提取細胞外囊泡和血漿中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄并擴增miR-191,采用是2-ΔΔCt法計算miR-191的表達水平。

分別采用細胞角蛋白19片段 (cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1)、 鱗 細 胞 癌 抗 原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)以及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附測定法)分析所有患者細胞外囊泡,以校準品濃度及熒光值做成標(biāo)準曲線,根據(jù)標(biāo)準曲線和樣本的熒光值計算樣本中CEA、SCCA、CYRRA21-1表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料采用x-±s 表示,采用t 檢驗,采用受試者工作特征 (receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析細胞外囊泡miR-191水平診斷效能,P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡和納米顆粒跟蹤技術(shù)分析分離出的細胞外囊泡 利用透射電鏡觀察分離到的早期非小細胞肺癌患者的外周血細胞外囊泡分布情況如圖1所示,大小約為40 nm,呈囊泡狀分布。納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示納米顆粒粒徑,最大峰值為(167.6±10.3)nm,大多數(shù)顆粒的直徑小于200 nm (圖1),符合細胞外囊泡的粒徑范圍,與透射電鏡的結(jié)果吻合。

2.2 2組外周血游離和細胞外囊泡miR-191水平比較 2組外周血游離miR-191表達水平數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=1.230,P ＞0.05),觀察組患者細胞外囊泡miR-191水平顯著高于對照組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t =15.686,P ＜0.05),見表1。

圖1 透射電鏡和納米顆粒跟蹤技術(shù)分析分離出的細胞外囊泡 A：透射電鏡;B：納米顆粒跟蹤技術(shù)

表1 2組患者外周血游離和細胞外囊泡miR-191相對表達水平比較(±s)

表1 2組患者外周血游離和細胞外囊泡miR-191相對表達水平比較(±s)

組別 例數(shù) 游離miR-191 細胞外囊泡miR-191對照組 60 4.3±1.0 5.1±1.1觀察組 60 5.3±1.2 12.3±2.1 t值 1.230 15.686 P 值 0.248 ＜0.001

2.3 ROC曲線分析細胞外囊泡miR-191水平對早期NSCLC的診斷價值 ROC 曲線分析結(jié)果顯示,細胞外囊泡miR-191水平預(yù)測早期NSCLC的曲線下面積為83.6% (P ＜0.05),95%CI：0.734～0.928。當(dāng)miR-191 水平為9.7時,可得出最佳敏感度 (76%)和特異度 (84.3%),細胞外囊泡miR-191 水平的曲線下面積顯著高于CEA(50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三項聯(lián)合(71.5%),見圖2。

2.4 早期NSCLC 患者外周血細胞外囊泡miR-191 表達水平與臨床病理相關(guān)性分析 早期NSCLC患者外周血細胞外囊泡miR-191表達水平與TNM 分期有關(guān) (t=3.126,P ＜0.05),與年齡、性別、吸煙史、病理分期及病理分型均無關(guān)(P 值均＞0.05),見表2。

3 討論

在機體內(nèi)所有細胞均分泌細胞外囊泡,但腫瘤細胞的細胞外囊泡的釋放量遠超正常細胞,因此,腫瘤患者外周血的細胞外囊泡絕大部分來自于腫瘤細胞,其組成成分,包括蛋白質(zhì)、DNA、mRNA以及miRNA 等,與腫瘤母細胞保持高度一致性[6]。提取外周血細胞外囊泡進行相關(guān)癌癥研究,為腫瘤細胞特征的分析提供了一個新的思路。在多種腫瘤進程中,miRNA 作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用,參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、血管生成和細胞凋亡等[7]。

圖2 受試者工作特征曲線分析miR-191、CEA、SCCA 以及CYRRA21-1對早期非小細胞肺癌的診斷價值

表2 早期非小細胞肺癌患者外周血細胞外囊泡miR-191表達水平與臨床病理相關(guān)性分析 (x-±s)

本研究對60例早期NSCLC 的進行研究,結(jié)果顯示2組外周血游離miR-191 表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05),觀察組患者細胞外囊泡miR-191水平顯著高于健康對照組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。表明外周血細胞外囊泡miR-191是NSCLC的高危預(yù)測因素。而兩組患者的外周血游離miR-191數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異。對于miRNA 而言,人體外周血的酸堿度、溫度以及各種酶類等物質(zhì)共同營造的環(huán)境使得大量游離miRNA 被降解,因此,外周血中游離miR-191的表達量個體差異很大,不能準確反映NSCLC患者腫瘤組織或腫瘤細胞中miR-191的表達情況[8-9]。相關(guān)研究也表明miR-191在多種腫瘤組織中呈不同程度的表達升高,并與腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移、凋亡以及細胞周期密切相關(guān)[10]。有研究表明miR-191 在NSCLC 表達水平顯著升高,且與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的生存期密切相關(guān)[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血細胞外囊泡的miR-191的表達水平與病理分期相關(guān),表明miR-191的表達水平隨著NSCLC腫瘤細胞惡性程度的增高而升高。其機制可能是miRNA191參與誘導(dǎo)細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,惡性程度越高的腫瘤組織及細胞,釋放出更多的細胞外囊泡[12]。

目前,臨床上NSCLC風(fēng)險預(yù)測的有效的血清標(biāo)志物包括CEA、SCCA、CYRRA21-1等[13]。本研究結(jié)果顯示細胞外囊泡miR-191 水平預(yù)測早期NSCLC的曲線下面積為83.6% (P ＜0.05),顯著 高 于 CEA (50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三項聯(lián)合 (71.5%)。從常規(guī)上講CEA、SCCA、CYRRA21-1可以作為NSCLC的診斷指標(biāo),但是由于在臨床上實際操作起來需要復(fù)雜的運算、缺乏統(tǒng)一標(biāo)準的診斷界點[14],此外對于早期NSCLC,這三種的診斷效能明顯低于外周血細胞外miR-191 的表達水平,所以本研究推薦采用外周血細胞外miR-191 的表達水平來替代CEA、SCCA、CYRRA21-1作為早期NSCLC的診斷[15]。

綜上所述,早期NSCLC患者外周血細胞外囊泡miR-191表達水平顯著增高,可以作為臨床檢測早期NSCLC的潛在標(biāo)志物之一,具有重要的臨床意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突