超聲造影評估裸鼠胰腺癌微血管分布的實驗研究

范 義

胰腺癌在消化道腫瘤中惡性程度最高，是全球第六大癌癥相關(guān)死亡原因，當前對于進展期胰腺癌仍缺乏有效的治療措施［1-3］。作為血供較為豐富的腫瘤，胰腺癌組織中的血管分布密度與其惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切［4-5］。通過計數(shù)腫瘤組織中CD34/CD31染色陽性細胞是目前臨床評價腫瘤微血管密度最常用的方法，該方法從微觀的角度來定量分析腫瘤組織內(nèi)微血管密度，其檢測在術(shù)后進行，對于其在鏡下視野的選擇上具有一定的主觀性，可能會對結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差，故需要一種更加準確而敏感的影像學(xué)方法來評估腫瘤血管分布和血流灌注［6-7］。本實驗通過建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，應(yīng)用超聲造影檢測腫瘤模型胰腺癌組織的血流灌注參數(shù)，并分析其與胰腺癌血管密度的相關(guān)性，旨在探討超聲造影在無創(chuàng)性評估胰腺癌微血管血流中的應(yīng)用價值及可行性。

材料與方法

一、實驗材料和試劑

1.實驗動物：BALB/c裸鼠50只，均為雌性，3～7周齡，來源于中國科學(xué)院上海實驗中心。

2.細胞和主要試劑：人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1［美國模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）］；重組人血管內(nèi)皮抑素（山東先聲麥得津生物制藥有限公司）；DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基、胎牛血清（杭州四季青有限公司）；超聲造影劑SonoVue（意大利Bracco公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和CD34抗體（美國Epitomics公司）；ABC免疫組化檢測試劑盒（北京中山生物工程有限公司）。

二、建立動物模型

參照文獻［2］報道方法，將裸鼠放置在層流凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。在DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基中重懸人胰腺癌PANC-1細胞，并將細胞懸液的密度調(diào)節(jié)至3×105/ml。將0.2 ml懸浮腫瘤細胞液經(jīng)皮下注射到3只裸鼠的右下肢，接受注射2周后，處死裸鼠并取出皮下腫瘤組織。在顯微鏡下將PANC-1細胞形成的腫瘤塊修剪成2 mm×2 mm×2 mm大小，原位移植到裸鼠胰尾部，共建立40只裸鼠胰腺癌原位移植模型，胰腺癌模型成功率為100%。

三、實驗儀器與方法

1.分組及處理：應(yīng)用隨機數(shù)字表法將40只裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型分成對照組和實驗組各20只。均繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)箱中，對照組裸鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水（每只0.2 ml），實驗組裸鼠經(jīng)腹腔注射重組人血管內(nèi)皮抑素（2 mg/kg），調(diào)整每次給藥劑量為0.2 ml，每天注射1次，共2周，于第4周終止體內(nèi)實驗。

2.超聲造影檢查：使用西門子Acuson S 2000彩色多普勒超聲診斷儀，9L4探頭，頻率4～9 MHz；配備反相脈沖諧波成像技術(shù)及時間-強度曲線分析軟件。采用腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉裸鼠，取仰臥位后涂抹耦合劑，先行常規(guī)超聲測量裸鼠胰腺腫瘤的長、寬、高徑線，確定腫瘤最佳顯示切面后固定探頭；使用滅菌生理鹽水將SonoVue振蕩稀釋成4.5μg/ml的混懸液，經(jīng)尾靜脈一次性注射造影劑混懸液0.2 ml，注射完成1 min后開啟超聲造影模式。造影錄像以DICOM的Uncompress格式導(dǎo)出，應(yīng)用SW-UCS-1超聲造影分析軟件獲得時間-強度曲線，記錄并分析胰腺腫瘤組織的峰值強度（PI）和曲線下面積（AUC），所有實驗動物均行超聲造影檢查。

3.免疫組織化學(xué)檢測：每組取10只裸鼠，處死后取出胰腺腫瘤，5%甲醛固定過夜，應(yīng)用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織進行脫水處理，包埋在石蠟中并切片。根據(jù)SP染色法進行免疫組織化學(xué)染色，測定CD34和VEGF在胰腺腫瘤組織中的陽性含量。隨機選取20個視野并在低倍鏡下拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析VEGF在樣本中的積分光密度值；于200倍光學(xué)顯微鏡下選取20個視野，計數(shù)每個視野下CD34陽性細胞作為微血管密度值，取平均值。

4.血管造影檢查：參照文獻［2］對裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型實施明膠-氧化鉛造影。每組取10只裸鼠，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉，開胸后在裸鼠心尖處行長約1 mm切口，隨即將24號留置針導(dǎo)管自切口插入，將明膠-氧化鉛溶液自導(dǎo)管灌入裸鼠全身動脈，待明膠-氧化鉛溶液凝固后取出胰腺腫瘤于X線下攝像。應(yīng)用Quantity One 4.6.2（BIO-RAD）軟件掃描X膠片中腫瘤內(nèi)血管組織的光密度值，用排水法測定胰腺腫瘤體積，計算腫瘤組織光密度值與腫瘤體積的比值，即腫瘤組織單位體積血管密度。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、實驗組與對照組超聲造影檢查結(jié)果比較

胰腺腫瘤組織呈不均勻低回聲影，其內(nèi)血流豐富，呈條索狀或網(wǎng)格狀。對照組裸鼠胰腺腫瘤組織的PI和AUC分別為（68.83±7.27）dB、859.93±114.27，均明顯高于實驗組［（32.64±5.15）dB、523.68±57.06］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.78、15.97，均P＜0.001）。見圖1。

二、實驗組與對照組裸鼠胰腺腫瘤中CD34和VEGF表達比較

對照組鏡下見腫瘤細胞為低分化胰腺癌，增殖活躍，腫瘤血供豐富；實驗組鏡下見腫瘤細胞血供較為貧乏，可見大量組織壞死（圖2）。對照組和實驗組腫瘤組織中的微血管密度值分別為32.10±6.43和11.70±3.49，提示實驗組中CD34陽性表達較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=34.84，P＜0.001）。VEGF在對照組和實驗組腫瘤組織中的積分光密度值分別為284.91±53.86和104.64±24.32，提示實驗組中VEGF陽性含量較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=27.13，P＜0.001）。

圖1 實驗組和對照組超聲造影圖

圖2 實驗組和對照組病理和免疫組織化學(xué)檢測圖（×200）

三、實驗組與對照組裸鼠胰腺腫瘤單位體積血管密度比較

采用明膠-氧化鉛血管造影法對實驗組和對照組共20只裸鼠實施血管造影，其中6只血管造影失敗，成功率為70%。對照組胰腺腫瘤血管分布較為密集，實驗組胰腺腫瘤血管數(shù)量明顯減少（圖3）；對照組和實驗組胰腺腫瘤組織單位體積血管密度分別為6.257±1.084和1.686±0.421，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=41.24，P＜0.001）。

圖3 對照組和實驗組血管造影圖（圖左為對照組，圖右為實驗組）

四、相關(guān)性分析

對照組裸鼠胰腺腫瘤組織的PI、AUC與微血管密度均呈正相關(guān)（r=0.857、0.762，均P＜0.001），與積分光密度均呈正相關(guān)（r=0.681、0.487，均P＜0.001），與單位體積血管密度均呈正相關(guān)（r=0.896、0.675，均P＜0.001）。見圖4。

圖4 對照組裸鼠胰腺腫瘤組織的PI（A）、AUC（B）與單位體積血管密度的相關(guān)性分析散點圖

討 論

超聲造影可較為直觀地顯示目標部位的血流量和血流速度，同時在超聲造影劑的協(xié)助下可分析目標組織的血流灌注增強特征，從而為研究腫瘤組織血管分布提供了一種非侵入性檢測手段［8-9］。超聲造影劑SonoVue是一種血池顯像劑，可停留在組織的微小血管中，從而對組織血管起示蹤作用。注入造影劑后超聲造影圖像信號與造影劑濃度呈線性關(guān)系，其時間-強度曲線參數(shù)（PI、AUC）的變化定量反映了組織內(nèi)血流灌注狀態(tài)變化。

在本實驗中，實驗組通過使用血管生長抑制劑治療后發(fā)現(xiàn)裸鼠胰腺腫瘤組織的PI和AUC均明顯低于對照組（均P＜0.05），提示對照組胰腺癌組織內(nèi)血流灌注較實驗組更豐富，微血管大量生成，微血管密度增加。為驗證超聲造影檢測本次實驗動物血流灌注情況，同時鑒于微血管密度值是反映腫瘤組織中血管生成的定量指標，本實驗分析比較了兩組裸鼠胰腺腫瘤的微血管密度，結(jié)果表明實驗組胰腺組織的微血管密度值顯著低于對照組（P＜0.05），提示對照組胰腺腫瘤組織內(nèi)微血管新生較實驗組更為活躍。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞通過旁分泌的方式釋放大量VEGF從而促進新生血管形成，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血流灌注增加［10-11］。本實驗結(jié)果表明實驗組裸鼠胰腺腫瘤組織中的VEGF表達明顯低于對照組（P＜0.05）。原因為實驗組通過注射重組人血管內(nèi)皮抑素，抑制了VEGF分泌，限制了腫瘤內(nèi)新生血管的生成。同時胰腺腫瘤組織的PI和AUC與VEGF表達均呈正相關(guān)，提示PI和AUC可有效無創(chuàng)性評估胰腺癌組織的微血管密度，從而反映其微血管生成狀態(tài)。

本實驗通過對裸鼠胰腺腫瘤實施明膠-氧化鉛血管造影，X光下可見對照組胰腺腫瘤血供極為豐富，而實驗組胰腺腫瘤血供較為稀疏，兩組胰腺腫瘤的單位體積血管密度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），從而在宏觀層面印證了血管生長抑制劑可有效抑制胰腺腫瘤血管生長，與CD34染色法及VEGF檢測結(jié)果相似，進而對裸鼠胰腺癌模型的血流灌注情況有了相對準確的評價。但微血管密度值測定和明膠-氧化鉛血管造影檢查均無法用于術(shù)前評估，不利于術(shù)前治療方案的確定，而超聲造影可用于術(shù)前診斷。為此，本實驗將對照組裸鼠胰腺腫瘤中超聲造影參數(shù)與微血管密度、單位體積血管密度進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明PI、AUC與微血管密度、單位體積血管密度均呈正相關(guān)，表明超聲造影血流灌注參數(shù)可有效、無創(chuàng)地反映裸鼠胰腺腫瘤內(nèi)血流灌注情況，即胰腺腫瘤內(nèi)的微血管密度越高，血流灌注量越大，腫瘤組織中的造影劑越多，病灶與周圍正常胰腺組織的對比越強，PI和AUC值就越大。本實驗通過微觀和宏觀兩個層面印證通過超聲造影參數(shù)評估胰腺腫瘤組織中的微血管血流的可行性，可為臨床無創(chuàng)性評估胰腺癌微血管生成狀態(tài)提供有價值的參考。

綜上所述，超聲造影血流參數(shù)PI和AUC可準確評估胰腺癌組織的血流灌注量；PI和AUC與胰腺癌血管密度密切相關(guān)。