神經(jīng)血管單元多靶點(diǎn)抗缺血性腦卒中的相關(guān)靶標(biāo)及通路研究

黃清，梁萍2，歐陽(yáng)揚(yáng)2，劉蕾2，楊鎏鑫2，劉佩2，劉玥彤2，蒙蘭青

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000)

缺血性腦卒中是受到遺傳和環(huán)境因素影響的系統(tǒng)性疾病，發(fā)生的分子機(jī)制是多基因、多功能蛋白相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常所致。氧/糖剝奪(OGD)細(xì)胞模型能夠模擬腦卒中的病理狀態(tài)，常用于模擬缺血性腦卒中的體外實(shí)驗(yàn)[1]。神經(jīng)血管單元(NVU)將腦卒中的組織關(guān)聯(lián)反應(yīng)視為一個(gè)整體，體現(xiàn)為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微血管之間相聯(lián)系及相互影響[2]?；虮磉_(dá)量的改變是缺血性腦卒中的重要特征，它的改變也伴隨著對(duì)多種蛋白質(zhì)功能的影響[3]。篩選缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元的差異表達(dá)基因，對(duì)探索缺血性卒中早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物、發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)等都有重要的意義。本研究基于神經(jīng)血管單元的主要組成成分，整合缺血性腦卒中體外模型的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管(血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞)芯片數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因，并對(duì)各組成成分構(gòu)建PPI互作網(wǎng)絡(luò)、功能注釋及通路分析等，為多靶點(diǎn)治療缺血性腦卒中提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)血管單元GEO芯片來(lái)源 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[4]中的GSE54037、GSE3045、GSE76739和GSE109233的芯片數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)。GSE54037[5]由葡萄牙神經(jīng)科學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)中心提供，該研究利用全基因組測(cè)序鑒定大鼠海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖(OGD)中的表達(dá)差異基因，實(shí)驗(yàn)分有對(duì)照組和OGD組(n=6)，每組分別在7 h和24 h(n=3)檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元的基因表達(dá)。GSE3045[6]是美國(guó)哥倫比亞大學(xué)對(duì)比星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常氧和缺氧狀態(tài)下的基因差異研究(n=3)。GSE76739[7]是意大利Fabio Martelli等人對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在暴露于常氧(n=2)、缺氧(n=4)條件下，分別于24 h和48 h研究的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化。在生理或缺血條件下，腦周細(xì)胞對(duì)于維持神經(jīng)血管單元的完整性起到重要的作用，瑞士隆德大學(xué)評(píng)估了體外培養(yǎng)的人腦周細(xì)胞在缺氧和/或葡萄糖剝奪后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在芯片GSE109233[8]中將選取常氧伴葡萄糖組和缺氧無(wú)葡萄糖組作為本次差異分析。

表1 神經(jīng)血管單元各組成成分的芯片基本信息

1.2 表達(dá)譜數(shù)據(jù)差異基因的篩選 GEO2R是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)自帶的在線分析工具，它是運(yùn)用基于R編程語(yǔ)言的開(kāi)源軟件Bioconductor的Biobase 2.30，GEOquery 2.40和limma 3.26.8 軟件包對(duì)原始序列矩陣數(shù)據(jù)文件中的兩組或多組樣本進(jìn)行分析，得出顯著性的差異表達(dá)基因。我們利用GEO2R工具分別對(duì)GSE54037、GSE3045、GSE76739和GSE109233中的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 缺血性腦卒中背景文庫(kù)的建立 為了使上述芯片篩選出來(lái)的差異基因更具有缺血性腦卒中的屬性，我們從GeneCards和OMIM人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)中以關(guān)鍵詞“ischemic stroke” or “cerebral infarction” or “ischemic cerebrovascular disease”檢索靶標(biāo)，作為缺血性腦卒中的背景文庫(kù)。

1.4 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元候選靶標(biāo)鑒定 用1.2中各芯片數(shù)據(jù)篩選的差異表達(dá)基因分別與缺血性腦卒中背景文庫(kù)做韋恩圖取交集，合并，再刪除重復(fù)值，即為缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元的候選靶標(biāo)。

1.5 候選靶標(biāo)的功能注釋和通路分析 為了更好地理解缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元發(fā)揮的生物學(xué)功能和參與的通路，我們使用OmicShare云平臺(tái)來(lái)進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.6 構(gòu)建候選靶標(biāo)的蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò) STRING[9]是一個(gè)涵蓋5090個(gè)物種，通過(guò)基因組預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序、保守/共表達(dá)和文獻(xiàn)文本挖掘等途徑，擁有24 584 628個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)。為了研究缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元各組分之間的相互作用，我們將候選靶標(biāo)批量導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，“Organism”選擇“Homo sapiens”，蛋白互作置信度為0.7，隱藏網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有連接的節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)出“TSV”格式的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，用Cytoscape軟件[10]中的cytoHubba插件[11]將整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)通過(guò)Degree算法，篩選出關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 缺血性腦卒中背景文庫(kù) 在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索到2266和279個(gè)缺血性腦卒中相關(guān)靶標(biāo)，將2者合并，且刪除重復(fù)值，最終得到2469個(gè)基因作為缺血性腦卒中的背景文庫(kù)。

2.2 神經(jīng)血管單元的差異表達(dá)基因 神經(jīng)元GSE54037芯片按2個(gè)不同的觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分組，根據(jù)p-value<0.05，|log(FC)|>1.2篩選得到差異表達(dá)基因，7 h組篩選到543個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)239個(gè)，下調(diào)304個(gè)，24 h組有678個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)145個(gè)，下調(diào)533個(gè)，分別繪制火山圖(見(jiàn)圖1A)。星形膠質(zhì)細(xì)胞GSE3045芯片根據(jù)表達(dá)量，設(shè)定p-value<0.05，|log(FC)|>1.5篩選得到差異表達(dá)基因1367個(gè)，其中有部分為探針對(duì)應(yīng)多個(gè)基因名，刪除重復(fù)值，整理后得到1389個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)1001個(gè)，下調(diào)388個(gè)，繪制火山圖(見(jiàn)圖1B)。血管內(nèi)皮細(xì)胞GSE76739芯片根據(jù)表達(dá)量，設(shè)定p-value<0.05，|log(FC)|>1.2得到417個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)222個(gè)，下調(diào)195個(gè)，繪制火山圖(見(jiàn)圖1C)。周細(xì)胞GSE109233芯片按2個(gè)不同的觀察時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分組，根據(jù)p-value<0.05，|log(FC)|>0.4篩選得到差異表達(dá)基因，2 h組篩選到156個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)63個(gè)，下調(diào)93個(gè)，6 h組篩選到1292個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)633個(gè)，下調(diào)659個(gè)，分別繪制火山圖(見(jiàn)圖1D)。

2.3 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元候選基因鑒定 利用Venn工具分別對(duì)GSE54037、GSE3045、GSE76739和GSE109233芯片的差異表達(dá)基因與缺血性腦卒中背景基因進(jìn)行交集分析，并繪制韋恩圖(見(jiàn)圖2)。將4個(gè)交集的基因進(jìn)行整合，刪除重復(fù)值，最終得到236個(gè)由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞基因芯片組成缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元的候選靶標(biāo)(見(jiàn)表2)。

圖1 神經(jīng)血管單元的差異表達(dá)基因火山圖

注：A為神經(jīng)元GSE540377芯片(A1為7h組，A2為24h組)；B為星形膠質(zhì)細(xì)胞GSE3045芯片；C為血管內(nèi)皮細(xì)胞GSE76739芯片；D為周細(xì)胞GSE109233芯片(D1為2h組，D2為6h組)；上調(diào)為紅色，下調(diào)為綠色

圖2 神經(jīng)血管單元差異表達(dá)基因與腦缺血背景基因韋恩圖

注：A為神經(jīng)元GSE540377芯片，B為星形膠質(zhì)細(xì)胞GSE3045芯片，C為血管內(nèi)皮細(xì)胞GSE76739芯片，D為周細(xì)胞GSE109233芯片

表2 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元候選靶標(biāo)列表

2.4 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元候選靶標(biāo)的功能注釋和通路分析 為了更好地理解缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元發(fā)揮的生物學(xué)功能和參與的通路，我們使用OmicShare云平臺(tái)來(lái)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO結(jié)果顯示，顯著性的生物學(xué)過(guò)程(Biological Process，BP)包括：免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)等；分子功能(Molecular Function，MF)包括：蛋白酶結(jié)合、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、G蛋白偶聯(lián)腺苷受體活性等；細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)包括：神經(jīng)元、血小板、細(xì)胞外基質(zhì)、纖維蛋白原復(fù)合物等(見(jiàn)圖3、表3)。KEGG結(jié)果顯示，神經(jīng)血管單元參與的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、腫瘤壞死因子信號(hào)途徑等(見(jiàn)圖4、表4)。

圖3 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元基因功能分析

表3 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元前10位生物學(xué)過(guò)程

注：p-value列下的E為科學(xué)計(jì)數(shù)

圖4 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元前20位KEGG通路柱狀圖

注：p-value列下的E為科學(xué)計(jì)數(shù)

2.5 缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元PPI分析 將236個(gè)候選基因批量導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，“Organism”選擇“Homo sapiens”，蛋白互作置信度為0.7，隱藏網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有連接的節(jié)點(diǎn)，得到236個(gè)節(jié)點(diǎn)連接679條邊，平均節(jié)點(diǎn)度：5.75，平均局部聚類系數(shù)：0.442，PPI富集p值：<1.0e-16的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖5A)。下載“TSV”格式的PPI數(shù)據(jù)，用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件將整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)通過(guò)Degree算法，篩選出連接度最大的前20個(gè)靶標(biāo)(VEGFA，IL6，CXCL8，SRC，IGF1，PLG，F(xiàn)GG，F(xiàn)GA，SERPINE1，CCL2，IL10，ITGB2，AHSG，SPP1，EDN1，ICAM1，TLR4，THBS1，CXCL1，MMP2)，即為神經(jīng)血管單元的樞紐靶標(biāo)(見(jiàn)圖5B、圖5C)。STRING中的通路分析顯示，顯著富集的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)等(見(jiàn)表5)。這些靶標(biāo)和通路可能是神經(jīng)血管單元在缺血性腦卒中的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖5 神經(jīng)血管單元候選靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)

注：A為236個(gè)候選靶標(biāo)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；B為由cytoHubba插件Degree算法得出的前20個(gè)連接度最大的靶標(biāo)互作子網(wǎng)絡(luò)；C為Degree排名方法

表5 神經(jīng)血管單元20個(gè)樞紐靶標(biāo)富集的部分信號(hào)通路

注：FDR列下的E為科學(xué)計(jì)數(shù)

3 討論

20世紀(jì)80年代，人類基因組計(jì)劃被提出，隨著生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展，基因芯片技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)疾病易感基因、分子診斷和靶向治療等醫(yī)學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域。腦卒中是全球死亡和致殘的主要原因之一，缺血性腦卒中占腦卒中的70%～80%。缺血性腦卒中不僅對(duì)神經(jīng)元造成損傷，神經(jīng)膠質(zhì)和血管成分也發(fā)生不同程度的損害。神經(jīng)血管單元(NVU)作為缺血性腦卒中生物學(xué)標(biāo)志物的來(lái)源[12]，研究其各組成部分之間的功能關(guān)系和調(diào)控的信號(hào)通路具有重要意義。

本研究對(duì)神經(jīng)血管單元的主要成分神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，得到236個(gè)缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元的靶標(biāo)。GO分析結(jié)果顯示，這些靶標(biāo)參與的生物過(guò)程主要與炎癥反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)等有關(guān)。KEGG顯著富集的信號(hào)通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用通路等。通過(guò)Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，VEGFA、IL-6、CXCL8和SRC在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的連接度均超過(guò)30，可見(jiàn)在缺血性腦卒中發(fā)揮重要作用。

VEGFA屬于PDGF/VEGF家族的成員，是具有約120～190個(gè)編碼氨基酸的同源二聚體糖蛋白[13]。其基因表達(dá)受缺氧刺激、細(xì)胞因子、性激素、趨化因子、生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)。低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是促進(jìn)其表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，激活HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠血管新生[14-15]。白細(xì)胞介素6(IL-6)是常見(jiàn)的炎性細(xì)胞因子，但在腦缺血中具有雙重作用。在急性期，IL-6由神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌作為炎癥介質(zhì)，但在亞急性期，由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，則可能參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用[16-17]。炎癥趨化因子CXC配體8(CXCL8)又稱白細(xì)胞介素8(IL-8)，有研究表明，抑制CXCL8可以抑制炎癥反應(yīng)[18]，而CXCL8基因沉默能激活PI3K-Akt信號(hào)通路[19]，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用[20]，有助于闡明中風(fēng)的潛在分子機(jī)制。此外，SRC激酶(一種原癌性酪氨酸激酶)已被證實(shí)，通過(guò)NR2A亞基的直接磷酸化來(lái)增強(qiáng)NMDA受體功能，調(diào)節(jié)突觸囊泡的谷氨酸釋放，并激活鈣通道[21-22]。因此，阻斷SRC活性可能會(huì)降低NMDA的功能，并調(diào)節(jié)與缺血性卒中興奮性毒性損傷相關(guān)的多種蛋白。

綜上所述，本研究利用多個(gè)基因表達(dá)譜芯片鑒定了缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元的靶基因并進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中，神經(jīng)血管單元主要參與炎癥反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程，并調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用通路等。我們著重分析了VEGFA、IL-6、CXCL8和SRC在缺血性腦卒中可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。這些神經(jīng)血管的關(guān)鍵靶標(biāo)和信號(hào)通路，可以為我們研究抗缺血性腦卒中靶向藥物治療提供一些新的思路。