淮山藥等4種藥食同源中藥對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能影響的對(duì)比研究

高長(zhǎng)曌，李方琪，嚴(yán) 婧，高一禎，夏晶瑩，郭冉冉，張 玉，楊丹聃

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

免疫調(diào)節(jié)在人體及動(dòng)物中發(fā)揮著重要的作用，一旦調(diào)控失衡，可能會(huì)造成如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病等多種自身免疫病。同時(shí)，利用正確調(diào)控的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，可以調(diào)節(jié)免疫缺陷疾病、感染性疾病、慢性病及腫瘤和癌癥等的治療?，F(xiàn)有臨床較多采用西藥治療的方法，但其具有作用單一、毒副作用明顯、沒有特異性療效等缺點(diǎn)。中藥因其含有多種免疫活性成分、多靶點(diǎn)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越得到臨床等廣泛認(rèn)可。最近，也有不少研究機(jī)構(gòu)在食物免疫調(diào)節(jié)疾病治療方面也取得突破性研究進(jìn)展，哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)像西蘭花這種我們常見的食物中含有的天然分子3-吲哚甲醇(I3C)可以通過(guò)調(diào)節(jié)抑制腫瘤生長(zhǎng)[1]。國(guó)內(nèi)也有許多食物有效成分的研究。香菇多糖能夠減輕化療所誘發(fā)脂代謝紊亂[2]。枸杞多糖(LBP)存在于枸杞子鐘，為其活性成分，有增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和顯著的抗腫瘤效應(yīng),其能帶動(dòng)機(jī)體主動(dòng)免疫能力，殺傷腫瘤細(xì)胞等等[3]。本實(shí)驗(yàn)選取淮山藥、薏米、蒲公英、酸棗仁4種日常生活常見的食物，同時(shí)是藥食同源的大宗藥材，其主要成分在各種文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)有不同程度提高機(jī)體免疫水平的作用[4-7]。構(gòu)建環(huán)磷酰胺免疫抑制模型探討4種中藥對(duì)免疫抑制小鼠機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能的具體調(diào)控作用，為其日后在臨床免疫疾病、腫瘤等的治療中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)6-8周ICR小鼠，體重18-22 g，90只均為雄性，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2018-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

蒲公英、淮山藥、酸棗仁、薏米4種藥材，每種300 g均購(gòu)自長(zhǎng)春市吉深藥店，且已粉碎加工，過(guò)12目篩。注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，批號(hào)：18022625，規(guī)格每只0.2 g,江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。1640培養(yǎng)基，GIBCO生產(chǎn)。新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司生產(chǎn)。鼠IgG ELISA 試劑盒、鼠IL-12 ELISA 試劑盒和鼠INF-γ試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1試劑配制 采用傳統(tǒng)水煎法供試藥液配制。按要求稱取藥材，用藥材6.5倍量水浸泡，武火煮至沸騰后用文火繼續(xù)煮至1.0 h，倒出藥液并過(guò)濾，向藥渣中加2倍蒸餾水進(jìn)行二煎，武火煮至沸騰后用文火繼續(xù)煮至1.0 h，倒出藥液并過(guò)濾，向二煎藥渣中再加2倍蒸餾水進(jìn)行三煎，武火煮至沸騰后用文火繼續(xù)煮至1.0 h，倒出藥液并過(guò)濾，合并三次所得的濾液,99-100℃濃縮至1.0 g/ml,即得所需藥液，50 ml離心管，標(biāo)記，4℃冰箱貯存。

1.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分成6組(每組15只)，稱量記錄每組小鼠的初始體重。分別設(shè)計(jì)為空白組、模型組、蒲公英組(5.0 g/kg)、酸棗仁組(5.0 g/kg)、淮山藥組(5.0 g/kg)、薏米組(5.0 g/kg)。除空白組和模型組灌喂0.9%生理鹽水外，其余各組每天灌喂一次相應(yīng)受試藥物，連續(xù)14天。給藥第4天起，除空白組，其余隔3天注射一次環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型。

1.3.3增重率與免疫器官臟器指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠稱重，計(jì)算增重率=(最終體重-初始體重)/初始體重×100%。末次給藥后，小鼠摘眼球處死。取脾臟和胸腺稱重，并觀察，計(jì)算相應(yīng)臟器指數(shù)(mg/g)=臟器重量(mg)/體重(g)。

1.3.4血清溶血素的測(cè)定 給藥第11天，小鼠腹腔注射0.2 ml 5%雞紅細(xì)胞懸液(CRBC)，末次給藥24 h后，摘眼球取血到EP管中，待血清析出，取上層血清到新的離心管，3 500 r/min分離血清，4℃?zhèn)溆?。血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清0.1 ml于試管中，與10%CRBC懸液0.05 ml混合置冰浴，再加10%補(bǔ)體0.1 ml混合，同時(shí)設(shè)置不加血清的對(duì)照組。37℃恒溫水浴30 min后，立即冰浴終止反應(yīng)。2 000 r/min 離心10 min，取上清0.1 ml，加都氏試劑0.3 ml，混勻，放置10 min后，取上清轉(zhuǎn)移至96孔板，同時(shí)設(shè)置半數(shù)溶血組，用酶標(biāo)儀于λ=540 nm，測(cè)定吸光度值(OD)，以對(duì)照組做空白調(diào)零，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，血清對(duì)照，補(bǔ)體對(duì)照，雞血對(duì)照，實(shí)驗(yàn)均設(shè)副孔。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示，

HC50=(樣品光密度值/CRBC半數(shù)溶血時(shí)光密度值)×稀釋倍數(shù)。

1.3.5免疫球蛋白、血清IL-12、 IFN-γ含量測(cè)定 末次給藥12 h后，眼眶取血，離心，收集血清，按照ELISA試劑盒提供的方法檢測(cè)血清中IgG、IL-12、IFN-γ含量。室溫平衡20 min后，向酶標(biāo)板中分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的待測(cè)血清樣品50 μl，同時(shí)設(shè)置空白孔，實(shí)驗(yàn)均設(shè)副孔。蓋封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。棄液，甩干，洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)抗體100 μl，37℃孵育60 min，棄液，甩干，洗滌液反復(fù)洗5次，拍干。依次每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值，運(yùn)用Origin軟件獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出待測(cè)樣品IgG、IL-2、IFN-γ含量水平。

1.3.6脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 取小鼠脾臟研磨，用含5%小牛血清(FCS)的培養(yǎng)液制備懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，每孔體積100 μl接種到96孔板，每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3副孔，對(duì)照組每孔補(bǔ)加100 μl的5%FCS培養(yǎng)液，刺激組每孔加100 μl的10 μg/ml的ConA。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。每孔加MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)孵育2 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100 μl 二甲亞砜(DMSO)，震蕩，使結(jié)晶物充分融解。在570 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(空白孔調(diào)零)。結(jié)果判定：SI (刺激指數(shù)) =Con A刺激孔A值/對(duì)照孔A值。

1.3.7吞噬 飼養(yǎng)結(jié)束前兩天，小鼠腹腔注射5%淀粉溶液1 ml，最后一次給藥后，腹腔注射3%雞紅細(xì)胞懸液0.5 ml，60 min后處死小鼠，腹腔打入2 ml生理鹽水，吸出腹腔液腹腔液在載玻片上涂片，Giemsa-wright染色液染色，40倍鏡顯微鏡下查找100個(gè)巨噬細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)。結(jié)果判定：吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬細(xì)胞數(shù)/ 100×100%；吞噬指數(shù):有吞噬作用的巨噬細(xì)胞吞入的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行多組均數(shù)間的單因素方差(ANOVA)分析，兩組均數(shù)間的相互比較采用LSD或 Dunnett法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果P<0.05為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)免疫抑制小鼠體重的影響

連續(xù)給藥14天后，稱量小鼠的最終體重，并分別計(jì)算增重率，結(jié)果表明，初始體重和最終體重各組間差別不大(P>0.05)，但增重率結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致各組增重情況有所變化，其中空白組平均增重率最高，使用藥物后，小鼠體重增長(zhǎng)程度較空白組均有不同程度的下降。與模型組相比，使用藥物各組體重增長(zhǎng)率升高并不明顯，其中薏米組甚至稍有下降，但與模型組相比P>0.05,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但薏米組增重率與正常組差別明顯(P<0.05)。見表1。

2.2 藥物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(mg/g)

14天后處死小鼠，取其脾臟、胸腺稱重并計(jì)算小鼠臟器指數(shù)，即器官重比體重。見表2，空白組、模型組、蒲公英組、酸棗仁組、淮山藥組、薏米組的脾臟指數(shù)分別為5.23±1.04，3.53±0.75， 4.30±0.31，4.82±1.19，5.04±0.61，4.59±0.73；胸腺指數(shù)分別為5.24±0.74，1.30±0.40， 1.98±0.31，2.48±0.73，2.15±0.44，2.21±0.69。與正?？瞻捉M比較，模型組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明造模成功。各組的脾臟和胸腺指數(shù)均有所上升。與模型組比較，只有淮山藥組差異顯著(P<0.05)，明顯恢復(fù)，接近正常水平，但所有實(shí)驗(yàn)組小鼠與正常組比較，差異并不明顯(P>0.05)。酸棗仁、淮山藥、薏米組相比模型組胸腺指數(shù)有明顯恢復(fù)(P<0.05)，盡管酸棗仁組指數(shù)最高，但與正常組相比，差異顯著(P<0.05)，仍未恢復(fù)到正常水平。說(shuō)明給藥后，4組藥物對(duì)脾臟和胸腺均有不同程度的積極作用，但胸腺指數(shù)仍未恢復(fù)到正常水平。

表1 4種中藥對(duì)小鼠體重的影響

注：a表示與空白組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與蒲公英組比較，P<0.05；d表示與酸棗仁組比較，P<0.05；e表示與淮山藥組比較，P<0.05。下表同。

表2 4種中藥對(duì)小鼠主要器官重量的影響

2.3 藥物對(duì)小鼠體液免疫的影響

2.3.1血清溶血素檢測(cè) 給藥第11天，腹腔注射5% CRBC，末次給藥24 h后，摘眼球取血，檢測(cè)計(jì)算，數(shù)據(jù)見表3。空白組、模型組、蒲公英組、酸棗仁組、淮山藥組、薏米組的半數(shù)溶血值分別為72.96±5.90、49.72±0.76、53.64±7.67、56.01±5.85、59.99±9.04、59.78±9.78、63.16±6.37。與模型組相比，各組的半數(shù)溶血值均有提高，高于模型組，但差異不顯著(P>0.05)，其中薏米組對(duì)于提高半數(shù)溶血值效果最好，接近空白組，與正常小鼠差異不顯著(P>0.05)，接近正常水平。

2.3.2血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子檢測(cè) 末次給藥12 h后，取血，ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IgG、IL-12、IFN-γ含量，數(shù)據(jù)見表4。空白組、模型組、蒲公英組、酸棗仁組、淮山藥組、薏米組的測(cè)得IgG含量分別為29.51±6.22、16.82±5.53、44.29±8.20、35.98±13.22、34.42±6.81。4個(gè)中藥實(shí)驗(yàn)組的IgG水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，表明幾種中藥均能提高免疫抑制小鼠免疫功能。其中蒲公英組與薏米組相比空白組增多最明顯(P<0.05)，表明其改善體液免疫作用顯著。

表3 4種中藥對(duì)小鼠血清溶血素的影響

IL-12的檢測(cè)結(jié)果為91.75±7.93、77.85±2.22、98.32±22.86、82.26±6.25、91.94±6.35、98.49±5.17。IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果為712.13±76.60、545.79±33.21、654.60±32.07、556.41±81.51、658.44±78.40、674.65±96.55。各組IL-12和IFN-γ的含量水平檢測(cè)具有相近趨勢(shì)。模型組和空白組相比，IL-12和IFN-γ的結(jié)果都有顯著差異(P<0.05)，與模型組相比，蒲公英、淮山藥、薏米組的IL-12和IFN-γ均有顯著增多(P<0.05)，其中薏米組在IL-12和IFN-γ的血清含量檢測(cè)中皆為最佳?？梢?種中藥在促進(jìn)小鼠體液免疫抗體分泌反面，有各自不同作用。

表4 4種中藥對(duì)小鼠血清IgG、IL-12、IFN-γ含量的影響

2.4 藥物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響

脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，空白組、模型組、蒲公英組、酸棗仁組、淮山藥組、薏米組的增值刺激指數(shù)分別為1.83±0.75、1.00±0.12、1.48±0.44、1.09±0.09、1.34±0.37、1.11±0.10。除酸棗仁組，其余各組的增值刺激指數(shù)均升高，其中蒲公英組最高，為1.48±0.44，其次為淮山藥組，為1.34±0.37，表明蒲公英組和淮山藥組小鼠細(xì)胞免疫水平得到明顯提高，較接近正常空白組(P>0.05)。

表5 4種中藥對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.5 藥物對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞功能的影響

最后1次給藥后，腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液，腹腔液涂片計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)見表6。空白組、模型組、蒲公英組、酸棗仁組、淮山藥組、薏米組的吞噬率分別為39.33±1.15、11.50±0.71、23.35±0.71、33.46±2.12、39.61±4.94、32.51±3.36；吞噬指數(shù)分別為0.42±0.19、0.14±0.06、0.38±0.04、0.32±0.10、0.43±0.12、0.37±0.12。與模型組相比，各組的吞噬率顯著提高(P<0.05)，吞噬指數(shù)也均不同程度升高，其中淮山藥組的吞噬率和吞噬指數(shù)升高最多，與模型組有顯著差異(P<0.05)，且都超過(guò)了正常水平，表明淮山藥組在提高吞噬細(xì)胞功能上效果顯著。

表6 4種中藥對(duì)小鼠吞噬功能的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠免疫抑制模型，探究小鼠灌胃蒲公英、酸棗仁、淮山藥、薏米4種藥食同源中藥的免疫調(diào)節(jié)作用。注射環(huán)磷酰胺后，小鼠的臟器比重、體液免疫、細(xì)胞免疫及吞噬作用等各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均顯著低于正常小鼠(P<0.05)，使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)。

使用藥物后，小鼠體重增長(zhǎng)程度較空白組均有不同程度的下降。與模型組相比，使用藥物各組體重增長(zhǎng)率升高并不明顯，其中薏米組甚至稍有下降，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析P值<0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

包括脾臟、胸腺等在內(nèi)的免疫器官是多種免疫細(xì)胞增殖、分化和成熟的場(chǎng)所，免疫器官指數(shù)可作為判斷免疫器官發(fā)育和機(jī)體免疫狀態(tài)的初步指標(biāo)[8]。脾臟作為人體外周最大器官，是淋巴細(xì)胞接受抗原刺激并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要場(chǎng)所[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物對(duì)脾臟指數(shù)均有所恢復(fù)，淮山藥組的脾臟指數(shù)有明顯恢復(fù)(P<0.05)，表明淮山藥組對(duì)于脾臟淋巴細(xì)胞增殖活化最為明顯。胸腺是T細(xì)胞成熟、分化的場(chǎng)所，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫[10]，數(shù)據(jù)顯示，酸棗仁、淮山藥、薏米組相比模型組胸腺指數(shù)有顯著恢復(fù)(P<0.05)但與正常組相比，仍未恢復(fù)到正常水平。與模型組相比，表明中藥對(duì)促進(jìn)免疫抑制小鼠免疫器官的發(fā)育具有較好的效果。

檢測(cè)機(jī)體紅細(xì)胞溶血過(guò)程中血紅蛋白的量可以反映抗體產(chǎn)生水平，進(jìn)而代表機(jī)體的體液免疫水平[11]。與模型組相比，四組血清溶血素水平均有不同程度的升高，其中薏米組的血清溶血素水平升高最多，接近正常，與空白小鼠無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明薏米組可以提高小鼠外周血的抗體生成率，增強(qiáng)體液免疫。但幾種藥未達(dá)到相對(duì)模型組十分顯著的提高效果(P>0.05)。IgG是血液里含量最高的免疫球蛋白，在抗體介導(dǎo)的防衛(wèi)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，對(duì)體液免疫至關(guān)重要[12]。各組相對(duì)模型組均顯著提高。IL-12具有刺激活化型T細(xì)胞增殖和誘發(fā)Th0細(xì)胞向Th1輔助細(xì)胞分化，標(biāo)志性的分泌IFN-γ、TNF-α等，并能誘導(dǎo)CTL和NK細(xì)胞毒性，有抗腫瘤的積極作用。IFN-γ能增強(qiáng)Th1細(xì)胞的活性，對(duì)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。薏米組的IL-12和IFN-γ兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均顯示比模型組顯著的提高，推測(cè)其可能促進(jìn)Th1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。

有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)可誘導(dǎo)脾T淋巴細(xì)胞增殖，用以測(cè)定淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能。淋巴轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果除酸棗仁組外，其他三組均對(duì)增殖有所提高，但不顯著，其中蒲公英組和淮山藥組結(jié)果顯示能刺激產(chǎn)生更多的淋巴細(xì)胞，表示其增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能較好，有趨近正常趨勢(shì)。

吞噬作用可評(píng)估動(dòng)物的非特異性免疫狀態(tài)。巨噬細(xì)胞吞噬作用是最重要的，可防御所有類型的入侵細(xì)胞，還可通過(guò)分泌細(xì)胞因子和處理呈遞抗原，間接發(fā)揮作用從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。與模型組相比，四種中藥組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)均明顯上升，其中淮山藥組吞噬率、吞噬指數(shù)上升最明顯均超過(guò)空白組。結(jié)果表明這四種中藥均能增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并且淮山藥的增強(qiáng)作用最明顯。

本實(shí)驗(yàn)采取的4種中藥：蒲公英、酸棗仁、淮山藥、薏米均為藥食同源物品，在生活中食用較為廣泛。以灌胃的方式作用在環(huán)磷酰胺抑制的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)免疫器官指數(shù)、特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，非特異性的吞噬功能均有不同程度的提高?；瓷剿幵谄⑴K指數(shù)、細(xì)胞免疫、吞噬等調(diào)節(jié)作用中均為相對(duì)最佳，而薏米在體液免疫的促進(jìn)溶血素和多種免疫細(xì)胞因子分泌的中也有相對(duì)最好效果，蒲公英、酸棗仁均有各自不同免疫調(diào)節(jié)作用。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，淮山藥的免疫調(diào)節(jié)相對(duì)更全面和顯著。實(shí)驗(yàn)對(duì)在免疫調(diào)節(jié)的臨床應(yīng)用上，可根據(jù)不同需求選用中藥調(diào)節(jié)免疫低下疾病，或者在腫瘤放療、化療患者作為輔助治療藥物或輔食增強(qiáng)免疫力有參考價(jià)值。