曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠的心腎保護作用及其機制探究

曾顯閣

(南陽市中心醫(yī)院 心臟大血管外科，河南 南陽473009)

慢性心力衰竭(CHF)作為大多數心臟疾病的最終階段，其發(fā)病機制復雜，常伴有腎、肺等器官功能異常[1]。有研究表明，CHF合并腎功能異常會加重患者的病情，致其住院率以及死亡率上升，從而導致患者心腎功能進一步惡化[2]。所以，保護患者腎功能是在治療CHF的同時不可忽視的一項重要工作。曲美他嗪可以提高患者心肌細胞功能，其能夠抑制脂肪酸氧化，阻止ATP水平下降，從而維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定[3]。本文旨在探討曲美他嗪對慢性心力衰竭(CHF)大鼠的心腎保護作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料鹽酸曲美他嗪片購于施維雅制藥有限公司，國藥準字H200554654；周齡雄性Wistar大鼠24只，體重210-250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022；基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子-β(TGF-β)、辣根過氧化物酶(HRP)購于美國Abcam公司；蘇木素染液、Masson染液試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，其他試劑購于上海生工生物股份有限公司。

全自動生化儀購自美國貝克曼有限公司；石蠟切片機購于英國Shandon公司；多功能酶標儀購于瑞士Tecan公司；電泳、轉膜系統(tǒng)、凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 CHF模型與分組將24只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組8只、造模組16只。造模組大鼠均注射1.5 ml/kg戊巴比妥鈉(3%)進行麻醉，在腹部正中間切口分層打開腹部，在左腎上腹主動脈分離出之后結扎，最后分層關閉腹腔。手術以后連續(xù)3 d均給予造模組大鼠腹腔注射20萬U青霉素。常規(guī)喂養(yǎng)4周以后，檢測左心室舒張末壓(LVEDP)，如果LVEDP≥15 mmHg即建模成功。在成功建立CHF模型后，將其隨機分成模型組8只、實驗組8只。給予實驗組大鼠曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，給予模型組和對照組大鼠等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠均灌胃4周。

1.3 血流動力學檢測對大鼠注射麻醉藥物以后，將其仰臥于手術臺上。于其頸部正中間的地方切口，在右側頸總動脈分離以后，結扎遠心端的頸總動脈，將近心端的頸總動脈用動脈夾夾住。然后在結扎處與動脈夾之間的動脈上剪一個小口，插入一根充滿肝素鹽水的導管。測量3組大鼠的LVEDP、左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.4 腎功能指標血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的檢測在檢測完血流動力學之后，于頸動脈處采血備用。利用全自動生化分析儀來測定3組大鼠的BUN、Scr水平。

1.5 心肌組織HE染色取適當體積的心肌組織，用4%甲醛溶液將其固定12 h，用石蠟包埋切片，脫蠟，室溫下用蘇木素染色，用水快速沖淋30-60 s，用1%鹽酸溶液浸潤1 s，用水沖洗1 min，室溫下用伊紅染色5-10 min，用水沖洗1 min。然后用梯度乙醇脫水，最后用二甲苯透明10 min，適量中性樹膠封片。水腫比例=水腫細胞數/總細胞數。

1.6 腎組織Masson染色取適當腎組織，4%甲醛溶液將其固定12 h，用梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，脫蠟，室溫下用蘇木素染色，水洗，加入Masson染液10 min，水洗，先后用1%冰醋酸溶液、2.5%磷鉬酸溶液浸洗，最后使用苯胺藍染液染色，0.2%冰醋酸溶液浸洗，乙醇脫水后用二甲苯透明封片。膠原纖維面積/視野面積的比值采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算。

1.7 MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白檢測將剝離出的腎組織剪碎以后，分離蛋白且進行濃度檢測。對蛋白進行變性、電泳，轉膜，封閉，4℃孵育過夜，緩沖液洗膜之后，用0.02%的辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗膜之后用增強型化學法(ECL)顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結果

2.1 3組大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠的LVEDP明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實驗組大鼠的LVEDP明顯降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高(均P<0.05)，見表1。

2.2 3組大鼠BUN、Scr水平比較與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠的BUN、Scr明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實驗組大鼠的BUN、Scr明顯降低(均P<0.05)，見表2。

表1 3組大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對照組，#P<0.05

2.3 3組大鼠心肌組織HE染色與對照組大鼠比較，模型組大鼠水腫比例明顯增大，心肌纖維排列明顯紊亂，細胞橫徑顯著增大、水腫(P<0.05)；與模型組大鼠比較，實驗組大鼠水腫比例明顯減小，心肌纖維排列比較整齊，細胞腫脹程度明顯減輕(P<0.05)，見圖1，表3。

表2 3組大鼠BUN、Scr水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對照組，#P<0.05

圖1 3組大鼠心肌組織HE染色(HE×400)

2.4 3組大鼠腎組織Masson染色與對照組大鼠比較，模型組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值增大，腎小球毛細血管處膠原纖維增生明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，實驗組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值明顯減小，腎小球毛細血管處膠原纖維增生明顯減少(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 3組大鼠腎組織Masson染色(Masson×200)

表3 3組大鼠心肌HE染色水腫比例、腎組織Masson染色視野面積比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對照組，#P<0.05

2.5 3組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量比較與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實驗組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量明顯降低(均P<0.05)，見圖3，表4。

表4 3組大鼠腎組織MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與對照組，#P<0.05

3 討論

目前，CHF在我國的發(fā)病率以及死亡率每年都在持續(xù)上升，其是由有多種病因共同作用導致的，而且CHF患者經常會伴隨出現腎衰竭的癥狀[4]。由CHF引起的腎衰竭稱之為心腎綜合征，是CHF的終末階段。近些年來，隨著社會老齡化的加劇慢性心血管疾病的發(fā)病率也在逐年上升，且經常有腎衰竭的現象出現。為了阻止心力衰竭與心腎綜合征的出現，阻斷神經內分泌系統(tǒng)激活與心室重塑是非常有必要的[5]。曲美他嗪可以保護心肌細胞功能，經常用于心臟的研究中。有研究報道，曲美他嗪可以改善大鼠心力衰竭模型神經激素的分泌，保護心腎功能[6]。

圖3 3組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量

本文研究結果顯示，與對照組大鼠相比較，模型組大鼠的LVEDP明顯升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(均P<0.05)，這說明大鼠舒張功能與心臟收縮在術后都有明顯下降，表示CHF模型建立成功。與模型組大鼠相比較，實驗組大鼠的LVEDP明顯降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高(均P<0.05)，與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠的BUN、Scr明顯升高(均P<0.05)；與模型組大鼠相比較，實驗組大鼠的BUN、Scr明顯降低(均P<0.05)，這說明曲美他嗪具有保護心腎功能的作用。為了驗證這一結果，通過HE染色對3組大鼠心肌組織進行病理學分析發(fā)現，與模型組大鼠比較，實驗組大鼠水腫比例明顯減小，心肌纖維排列比較整齊，細胞腫脹程度明顯減輕(P<0.05)。與張紅等人文獻報道的結果一致[7]。

CHF會引發(fā)患者出現腎小管間質纖維化，其是所有慢性腎臟疾病的最終階段[8]。腎小管間質纖維化的主要特點是細胞外基質(ECM)會過度沉積在腎間質中[9]。Ⅳ型膠原作為腎小球基底膜的重要組成成分，能夠被金屬蛋白酶(MMPs)家族的兩個關鍵成員MMP-2、MMP-9調節(jié)降解，MMP-2、MMP-9可以通過調節(jié)Ⅳ型膠原的降解來調節(jié)生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下腎臟ECM的代謝平衡[10]。α-SMA作為一種特異性蛋白，可以用來標記腎小管間質纖維化[11]。TGF-β能夠通過介導腎間質發(fā)生纖維化與腎小球出現硬化來直接調控腎小球的損傷過程[12]。腎小管上皮細胞在受到刺激以后，會分化成肌成纖維細胞，通過增加結締組織生長因子和TGF-β的水平而出現腎纖維化[13]。本文研究結果顯示，實驗組大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相對表達量明顯降低(均P<0.05)，可以進一步說明曲美他嗪能夠改善CHF大鼠腎臟纖維化的程度。為了驗證這一結果，通過Masson染色對3組大鼠腎組織進行病理學分析發(fā)現，與模型組大鼠比較，實驗組大鼠腎組織膠原纖維面積/視野面積的比值明顯減小，腎小球毛細血管處膠原纖維增生明顯減少(P<0.05)。這一結果與譚淑娜等人的結果吻合[14]。

綜上所述，曲美他嗪可以明顯保護CHF大鼠的心腎功能，能夠改善心腎組織結構。