黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶工藝優(yōu)化

湯 勇，丁泓皓，蔡 俊

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

黑曲霉是曲霉屬真菌的一個(gè)常見種，是廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中的絲狀子囊真菌[1]。黑曲霉是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等[2-3]。除此之外，黑曲霉具有強(qiáng)大的聚合物降解酶系，已有黑曲霉作為木聚糖降解酶系的強(qiáng)大生產(chǎn)者，可以在各種廉價(jià)的培養(yǎng)基，比如玉米粉、玉米芯粉、麩皮等上快速生長和發(fā)酵產(chǎn)酶[4-7]的相關(guān)報(bào)道。

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年都會(huì)產(chǎn)生大量可回收再利用的農(nóng)業(yè)廢棄物和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國收獲玉米后的副產(chǎn)物——玉米芯量超過2 000萬 t。如何更好地利用該寶貴的可再生資源已受到世界各國的高度重視。目前國內(nèi)外采用微生物菌種液態(tài)發(fā)酵玉米芯粉的報(bào)道較少，且主要用于生產(chǎn)蛋白飼料，很少有關(guān)于產(chǎn)酶的報(bào)道[8-10]。玉米芯粉含有豐富的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是一種優(yōu)質(zhì)的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基碳源[11]。

木質(zhì)纖維素由3 個(gè)主要組分組成：纖維素（30%～50%干質(zhì)量）、半纖維素（20%～40%）、木質(zhì)素（15%～25%）和灰分及其他成分（3%～10%）。雖然纖維素和半纖維素都可以水解成單個(gè)糖分子，但半纖維素的鏈短、分支少和非結(jié)晶性質(zhì)使其比纖維素更適合水解[12]。硬木和許多農(nóng)作物，如玉米芯粉的主要半纖維素是木聚糖，伴隨少量阿拉伯聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖，是木聚糖降解酶系的誘導(dǎo)碳源。木聚糖的完全降解需要木聚糖酶和木糖苷酶2 種關(guān)鍵酶，其中木聚糖酶破壞木聚糖骨架成更短的可溶性低聚木糖；木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非還原末端釋放木糖[13-14]。木糖苷酶在自然界中比較常見于絲狀真菌[15-16]，如曲霉菌屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）、木霉菌屬（Trichoderma）等。其中黑曲霉[17]是比較常見的可以利用玉米芯粉發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶的微生物。木糖苷酶在新能源、化學(xué)制藥、食品和飲料、纖維飼料、造紙工業(yè)等方面都有非常重要的用途[18-22]，尤其是食品領(lǐng)域，比如木糖苷酶可以降低啤酒和果汁的黏度和渾濁度，提高產(chǎn)品質(zhì)量[23-24]；木糖苷酶可以用于烘烤，不僅改善面團(tuán)體積還可以延長其保質(zhì)期[25]；木聚糖經(jīng)過木糖苷酶處理后得到的木糖可用于生產(chǎn)木糖醇，作為食品甜味劑[26-28]，得到的低聚木糖作為益生元可以選擇性促進(jìn)益生菌生長，從而緩解便秘、促進(jìn)消化[29-30]，所以提高微生物發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶的能力非常有必要。

微生物所產(chǎn)木糖苷酶可以將豐富、廉價(jià)、可再生資源生物轉(zhuǎn)化為重要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，其在食品領(lǐng)域具有較高的商業(yè)價(jià)值和市場潛力。但是自然界中野生型微生物產(chǎn)木糖苷酶的酶量低、成本高等問題極大限制了木糖苷酶的廣泛應(yīng)用，因此本研究擬通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化野生型菌株黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶的發(fā)酵工藝和發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為木糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯粉 武漢新華揚(yáng)股份有限公司；黑曲霉CAN保藏于湖北工業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心A610實(shí)驗(yàn)室。

蔗糖、木糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硝酸鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、碳酸鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、對硝基苯酚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對硝基苯基吡喃木糖苷 上海源葉生物科技有限公司。

菌種種子培養(yǎng)采用土豆培養(yǎng)基，配制過程：稱取土豆200 g，去皮切成丁，加適量蒸餾水，充分煮沸，用4 層紗布過濾，濾液加入20 g葡萄糖，補(bǔ)足水至1 000 mL，高壓滅菌，備用?；罨瘯r(shí)于以活化的黑曲霉斜面接種，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)40 h。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall LYNK 6000超速離心機(jī) 美國Thermo公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZSD-12全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司；ZQZY-CF8系列三層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海知楚儀器有限公司；SYNERGY2酶標(biāo)儀 基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木糖苷酶活力的測定

取0.1 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的發(fā)酵上清液加入0.9 mL 0.5 mg/mL的對硝基苯基吡喃木糖苷溶液（pH 4.5），在70 ℃水浴中以應(yīng)30 min后，立即加入0.5 mL 2 mol/L碳酸鈉溶液終止以應(yīng)，混和均勻后在410 nm波長處測溶液的吸光度。通過測定在410 nm波長處釋放出的對硝基苯酚吸光度計(jì)算酶活力。1 個(gè)木糖苷酶的酶活力單位（U/mL）定義為每分鐘生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量[31]。

1.3.2 黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用單因素法研究發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速對CAN發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶的影響。產(chǎn)木糖苷酶初始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯粉20 g/L，硝酸鈉2.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.0 g/L，氯化鈣2.5 g/L；初始發(fā)酵條件：接種量5%，裝液量100 mL/300 mL，溫度28 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速160 r/min，pH值自然。

發(fā)酵時(shí)間：在上述初始發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，每隔12 h測定一次發(fā)酵液中木糖苷酶活力；發(fā)酵溫度：以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，分別在25、28、31、34、37、40、43 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力；搖瓶接種量：以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，改變接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%（V/V），發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力；發(fā)酵初始pH值：以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，調(diào)整初始pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力；搖瓶裝液量：以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，采用300 mL搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為30、50、70、90、110 mL，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力；搖瓶轉(zhuǎn)速：以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，搖瓶轉(zhuǎn)速分別為120、140、160、180、200、220 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3 黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)選及添加量的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基碳源選擇蔗糖、麩皮、木糖、淀粉、玉米粉、玉米芯粉、低聚木糖、葡萄糖，碳源添加量為20 g/L，培養(yǎng)基其他成分保持不變，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

選擇酶活力最高的碳源為最佳碳源，改變其添加量分別為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，培養(yǎng)基其他成分保持不變，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的優(yōu)選及添加量的優(yōu)化

以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，發(fā)酵培養(yǎng)基氮源選擇硫酸銨、玉米漿、氯化銨、硝酸鉀、酵母膏、硝酸鈉、大豆粉、麩皮、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，氮源添加量為10 g/L，培養(yǎng)基其他成分保持不變，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

選取較優(yōu)的幾種氮源做復(fù)合氮源實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基其他成分保持不變，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。以最優(yōu)復(fù)合氮源為研究對象，培養(yǎng)基其他成分保持不變，總添加量分別為5、10、15、20、25、30 g/L，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽的優(yōu)化

以上述實(shí)驗(yàn)最佳結(jié)果為前提，發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽只添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂和氯化鈣中的一種，其添加量為0.5 g/L，發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

在工藝優(yōu)化中，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)可以通過較少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多因素中快速篩選出對目的指標(biāo)影響最大的顯著性因素，以供進(jìn)一步研究[32]。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert軟件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，篩選出對菌株產(chǎn)木糖苷酶影響比較顯著的因素。發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.5 最低添加量試驗(yàn)

以Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的不顯著性因素為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基最經(jīng)濟(jì)為目的，研究對黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶影響不顯著因素的最低添加量。發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

以Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著性因素為基礎(chǔ)，為進(jìn)一步確定最佳培養(yǎng)基組成，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定這些顯著因素的最佳區(qū)域。依據(jù)顯著性因素正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)合理的步長，增加試驗(yàn)的密集度，逼近效果最好的區(qū)域[33]。發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.3.3.7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面試驗(yàn)通過合理地選取試驗(yàn)點(diǎn)和迭代策略，克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，在對微生物培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分選擇的優(yōu)化中均取得了顯著的成效。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面三維立體分析圖，并預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成。發(fā)酵條件為1.3.2節(jié)優(yōu)化后條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定木糖苷酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，包括回歸分析、二次多項(xiàng)式回歸方程、方差分析和響應(yīng)面圖。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

圖1 發(fā)酵條件對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響Fig. 1 Effect of fermentation conditions on xylosidase activity of A. niger

由圖1A可知，在發(fā)酵前期培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌株的生長繁殖。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)酶量逐步增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到達(dá)144 h時(shí)酶活力達(dá)到最高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒物質(zhì)的積累導(dǎo)致發(fā)酵液中酶活力有所下降，故選擇發(fā)酵周期為144 h[34]。

由圖1B可知，當(dāng)溫度在25～34 ℃之間時(shí)，隨著溫度的升高，菌株產(chǎn)木糖苷酶活力隨著升高，在溫度34 ℃時(shí)，酶活力最高，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，木糖苷酶活力開始降低。由于微生物的生長和產(chǎn)物的合成需要在適宜的溫度下進(jìn)行，一般溫度升高，生長代謝加快，但溫度過高，會(huì)導(dǎo)致菌體提前衰老，產(chǎn)酶減少。同時(shí)溫度還會(huì)影響微生物合成產(chǎn)物的方向。故選擇發(fā)酵溫度為34 ℃。

由圖1C可知，當(dāng)接種量從1%增加到7%時(shí)，發(fā)酵液中木糖苷酶活力最高，當(dāng)接種量繼續(xù)增大時(shí)，木糖苷酶活力開始下降。因?yàn)檩^大的接種量導(dǎo)致菌株生長過快，培養(yǎng)基黏度增加，溶氧不足，不利于菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶，故選擇最佳接種量為7%。

由圖1D可知，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值為3.0，木糖苷酶活力最高。因?yàn)閜H值會(huì)影響各種酶活力、菌對基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而影響菌的生長和產(chǎn)物的合成，同時(shí)已知大多數(shù)木糖苷酶在酸性條件下較穩(wěn)定[27]，故選擇發(fā)酵液初始pH值為3.0。

由圖1E可知，當(dāng)裝液量為110 mL（300 mL三角瓶）時(shí)，木糖苷酶活力最高，此時(shí)的發(fā)酵液中的溶氧量最適合菌株發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶，故選擇裝液量為110 mL。

由圖1F可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，木糖苷酶活力最高，隨著轉(zhuǎn)速的增大，產(chǎn)生的剪切力會(huì)影響菌絲體的生長，導(dǎo)致菌株產(chǎn)木糖苷酶能力降低，故選擇最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2 黑曲霉CAN產(chǎn)木糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源及碳源添加量的優(yōu)選

圖2 碳源種類（A）及碳源添加量（B）對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響Fig. 2 Effect of the type (A) and concentration (B) of carbon source on xylosidase activity of A. niger

由圖2A可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為玉米芯粉時(shí)，產(chǎn)木糖苷酶活力最高，麩皮次之。玉米芯粉和麩皮中木聚糖含量較高，能夠誘導(dǎo)菌株產(chǎn)木糖苷酶[35]。其他可以被直接利用的碳源不能誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶或者對菌株產(chǎn)酶具有抑制作用[36-37]，故選擇玉米芯粉為最佳碳源。

由圖2B可知，當(dāng)碳源添加量為25 g/L時(shí)，木糖苷酶活力最高，當(dāng)碳源添加量過低時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，造成木糖苷酶活力較低。當(dāng)碳源添加量過高時(shí)，培養(yǎng)基黏度增大，發(fā)酵過程中的傳質(zhì)和溶氧會(huì)受到影響，導(dǎo)致木糖苷酶活力較低，故選擇碳源添加量為25 g/L。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源及氮源添加量的優(yōu)選

圖3 氮源種類（A）和氮源總添加量（B）對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響Fig. 3 Effect of the type (A) and concentration (B) of nitrogen source on xylosidase activity of A. niger

表1 復(fù)合氮源對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響Fig. 1 Effect of combinations of nitrogen sources on xylosidase activity of A. niger

細(xì)菌、霉菌和酵母都要利用氮元素合成酶，因此氮源的選擇和添加量對微生物產(chǎn)酶至關(guān)重要。由圖3A可知，菌株利用不同氮源產(chǎn)木糖苷酶活力差別較大，一般情況下，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源對微生物內(nèi)酶的合成與分泌具有更明顯的促進(jìn)作用[26,38]。因此選擇蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硝酸鉀做復(fù)合氮源實(shí)驗(yàn)。由表1可知，利用幾種較優(yōu)的單一氮源復(fù)合后，菌株產(chǎn)酶能力大都有所提高。因此選擇最優(yōu)的復(fù)合有機(jī)氮源配比，即蛋白胨-酵母粉1∶2。

由圖3B可知，隨著氮源總添加量的逐漸增加，菌株利用氮源合成木糖苷酶的量逐漸增加，氮源總添加量在10 g/L時(shí)，木糖苷酶活力最高，氮源總添加量超過10 g/L時(shí)，酶活力開始逐漸降低，故選擇氮源添加量為10 g/L。

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽的優(yōu)選試驗(yàn)

圖4 無機(jī)鹽種類對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響Fig. 4 Effect of different inorganic salts on xylosidase activity of A. niger

由圖4可知，單一無機(jī)鹽對菌株產(chǎn)酶的影響中，磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀較優(yōu)，故選擇磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣進(jìn)行后續(xù)Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

通過對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以基本確定Plackett-Burman設(shè)計(jì)所需的培養(yǎng)基組分，然后通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選得到培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酶有顯著性影響的組分，以便對培養(yǎng)基的組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。按照Design-Expert軟件設(shè)計(jì)，次數(shù)20 次，每組3 個(gè)平行，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Plackett-Burman design with experimental results

由表3可知，回歸模型的P值小于0.05，表明該模型顯著。玉米芯粉、蛋白胨、硫酸鎂的P值在95%的置信區(qū)間內(nèi)小于0.05，即說明玉米芯粉、蛋白胨、硫酸鎂這3 種培養(yǎng)基組成成分是影響CAN菌株產(chǎn)木糖苷酶的顯著性因素，其中玉米芯粉、蛋白胨為正效應(yīng)，硫酸鎂為負(fù)效應(yīng)。由方差分析可知，決定系數(shù)R2為0.873 1，表明87.31%的數(shù)據(jù)都能用此模型解釋。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸模型方差及主效應(yīng)分析Table 3 ANOVA of the mathematical model established based on Plackett-Burman design and significance test

2.2.5 最低添加量試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的影響菌株產(chǎn)木糖苷酶的不顯著因素，即酵母粉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鈣，做最低添加量試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 不顯著因素的最低添加量試驗(yàn)Table 4 Results of lowest addition experiments on medium ingredients without significant influence on xylosidase activity of A. niger

由表4可知，本著降低生產(chǎn)成本和簡化培養(yǎng)基組分的原則，選擇各因素下酶活力達(dá)到峰值時(shí)所對應(yīng)的添加量為其最低添加量，即磷酸氫二鉀0 g/L、磷酸二氫鉀0 g/L、氯化鈉1.0 g/L、氯化鈣1.5 g/L、酵母粉8.0 g/L。

2.2.6 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸分析和方差分析，顯著性因素中玉米芯粉和蛋白胨為正效應(yīng)，硫酸鎂為負(fù)效應(yīng)，按照各因素的正負(fù)效應(yīng)設(shè)定最陡爬坡試驗(yàn)。其他成分為酵母粉8.00 g/L、氯化鈉 1.00 g/L、氯化鈣1.50 g/L。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Steepest ascent design with experimental results

由表5可知，當(dāng)玉米芯粉、蛋白胨和硫酸鎂添加量分別為30、4.0 g/L和0.8 g/L時(shí)，菌株產(chǎn)木糖苷酶活力最高，將其作為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化組分的添加量。

2.2.7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表6 響應(yīng)面二次式模型的方差分析Table 6 ANOVA of response surface quadratic model

通過最陡爬坡試驗(yàn)得到的玉米芯粉30.00 g/L、蛋白胨4.00 g/L、硫酸鎂0.80 g/L為中心點(diǎn)，以木糖苷酶活力為響應(yīng)值進(jìn)行3因素5水平中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：酵母粉8.00 g/L、氯化鈉1.00 g/L、氯化鈣1.50 g/L。以酶活力作為響應(yīng)值，利用軟件構(gòu)建二次式模型，模型方程為?=14.35+1.13A+0.95B-0.66C-0.48AB+0.69AC+0.12BC-0.70A2-0.49B2-0.36C2。由響應(yīng)面二次式模型的方差分析可知，方程中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2各項(xiàng)的P值均小于0.05，說明以上各項(xiàng)對產(chǎn)酶有顯著性影響。同時(shí)失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P值大于0.05，則說明模型能與數(shù)據(jù)準(zhǔn)確擬合。經(jīng)回歸方程方差分析結(jié)果驗(yàn)證表明，模型的P值小于0.05，方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，說明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好，適用于產(chǎn)酶的理論預(yù)測。

由表6可知，玉米芯粉和蛋白胨、玉米芯粉和硫酸鎂之間存在著顯著的交互作用，通過軟件對回歸方程中的AB、AC交互項(xiàng)繪制響應(yīng)面分析圖，如圖5所示。

圖5 玉米芯粉分別和蛋白胨添加量（a）、硫酸鎂添加量（b）的交互作用對CAN產(chǎn)木糖苷酶的影響響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots showing the effects of interactions between corncob and peptone (a) as well as MgSO4 (b) on xylosidase activity of A. niger

由模型和軟件分析可知得到極大值點(diǎn)所對應(yīng)的各因素的編碼值分別為0.31、0.74、-0.48，換算成實(shí)際值，分別是玉米芯粉31.55 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸鎂0.70 g/L。在此預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基組分下木糖苷酶活力可以達(dá)到15.04 U/mL。用得到最佳培養(yǎng)基組成玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸鎂0.70 g/L、氯化鈉1.00 g/L、氯化鈣1.50 g/L，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均酶活力為14.87 U/mL。實(shí)測值與回歸方程預(yù)測值（15.04 U/mL）吻合良好。

3 結(jié) 論

采用單因素試驗(yàn)，確定黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)木糖苷酶的最適發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值、裝液量和搖瓶轉(zhuǎn)速。然后在上述最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，結(jié)合Plackett-Burman、最低添加量、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面法中心組合方法建立了黑曲霉發(fā)酵玉米芯粉產(chǎn)木糖苷酶工藝中木糖苷酶活力響應(yīng)模型。經(jīng)回歸方程的方差分析表明，模型的P值小于0.05，方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，說明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好，適用于產(chǎn)酶的理論預(yù)測。用上述模型得到的最佳培養(yǎng)基組成為玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸鎂0.70 g/L、氯化鈉1.00 g/L、氯化鈣1.50 g/L，做3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均酶活力為14.87 U/mL。實(shí)測值與回歸方程預(yù)測值（15.04 U/mL）吻合良好。經(jīng)過上述優(yōu)化后菌株產(chǎn)木糖苷酶的活力是優(yōu)化前的8.89 倍。