果蔬發(fā)酵乳酸菌的篩選、鑒定及發(fā)酵性能分析

王 璐，王偉偉，王艷霞，張 瑤,，宋元達(dá)

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255020）

乳酸菌是指能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸并在自然界中廣泛分布的一類革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱[1-3]。由于乳酸菌具有營(yíng)養(yǎng)、健康的特殊功效，風(fēng)靡在歐、美、日、韓等市場(chǎng)，并被廣泛應(yīng)用于保健食品、飲料、肉制品、乳制品等食品及預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-10]。近年來關(guān)于乳酸菌發(fā)酵水果蔬菜飲料的研究日益增多。果蔬經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)成分得到很好的保留和細(xì)化，不僅風(fēng)味極佳，酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也更高[11-14]。目前研究者對(duì)多種果蔬原料如南瓜、雪蓮果、蘋果、梨、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、番茄、龍眼、火龍果等單一果蔬或混合果蔬進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵工藝研究[14-20]。如今國(guó)內(nèi)市場(chǎng)用于果蔬發(fā)酵的乳酸菌種多為商業(yè)化牛乳發(fā)酵菌種，雖然也有研究者從泡菜、果蔬醬、水果發(fā)酵液中分離篩選乳酸菌[21-23]，但篩選的菌株仍存在利用果蔬能力有限及對(duì)發(fā)酵材料和發(fā)酵環(huán)境適用性差的問題。因此，開發(fā)具有優(yōu)良發(fā)酵性能的果蔬發(fā)酵專用菌株至關(guān)重要。本研究采用強(qiáng)酸、高鹽和高糖的MRS培養(yǎng)基從自然發(fā)酵蘋果原漿樣品中分離篩選出乳酸菌種并進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)通過測(cè)定菌體干質(zhì)量、活菌數(shù)、pH值和酸度等指標(biāo)對(duì)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基和果蔬原漿中的發(fā)酵性能進(jìn)行分析。該研究有望為豐富果蔬發(fā)酵專用菌種庫(kù)以及開發(fā)新型果蔬發(fā)酵產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS分離培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐溫80 1 g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸鈉5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃濕熱滅菌30 min。

初篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.5%碳酸鈣，乳酸調(diào)pH 2.0。

高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加10%氯化鈉和0.5%碳酸鈣。

高糖復(fù)篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到30%，添加0.5%碳酸鈣。

明膠培養(yǎng)基：蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化鈉 5 g/L，明膠100 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃濕熱滅菌15 min。

果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基：將蘋果、胡蘿卜、西瓜、西紅柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分別榨汁除渣制得發(fā)酵果醬，然后按1∶1∶1∶1比例混合經(jīng)巴氏滅菌后4 ℃冷藏。按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化鈣0.5%、磷酸氫二鈉0.05%、磷酸二氫鈉0.05%、硫酸鎂0.03%、檸檬酸0.1%的配比配制，除果蔬和檸檬酸外其余成分于115 ℃濕熱滅菌15 min。

菌種生理生化鑒定用培養(yǎng)基見文獻(xiàn)[24-25]。

1.2 儀器與設(shè)備

QHZ-12A隔水式恒溫培養(yǎng)箱 江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；高溫高壓滅菌鍋 廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；分析天平 德國(guó)Mettler-Toledo公司；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺(tái) 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離篩選

取沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿，用0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，吸取適宜稀釋度溶液涂布至MRS分離培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，挑取菌落黃色范圍大并具有乳酸菌典型特征的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。將革蘭氏染色陽性菌落接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)不少于3 次，直至得到單菌種純培養(yǎng)物，作為乳酸菌備選菌株。

將備選菌株分別接種在初篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，然后挑選目標(biāo)菌落繼續(xù)在高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，挑選黃色鈣圈明顯的單菌落繼續(xù)點(diǎn)接在高糖復(fù)篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，挑取明顯變黃的菌落轉(zhuǎn)至MRS固體斜面，低溫保藏備用。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)：將菌株活化后接種在MRS固體平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色：將菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2.2 耐受性分析

將菌株甘油凍存管分別活化至菌體濃度調(diào)至2.5×108CFU/mL，然后分別接種于pH 2.0～3.0、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%～10.0%或葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.0%～30.0%的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，于0 h和3 h分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以0 h樣品為對(duì)照，按式（1）計(jì)算樣品中菌株的存活率：

1.3.2.3 生理生化鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行過氧化氫酶以應(yīng)、硫化氫、明膠液化、吲哚產(chǎn)生、石蕊牛乳、乳酸紙層析以及碳水化合物利用等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[26]進(jìn)行綜合評(píng)定。

過氧化氫酶以應(yīng)：將篩選菌株接于MRS斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，滴加幾滴過氧化氫溶液，觀察是否產(chǎn)生氣泡。

硫化氫實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)7 d觀察是否變黑。

明膠液化實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株接種于明膠培養(yǎng)基試管，20 ℃培養(yǎng)觀察菌生長(zhǎng)情況及明膠是否融化。

吲哚實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，后加入乙醚和吲哚試劑，觀察液層界面呈現(xiàn)玫瑰色則為陽性，否則為陰性。

石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株接種于石蕊牛乳試管中，37 ℃培養(yǎng)1、3、5、7、14 d觀察有無酸凝、酶凝、胨化、還原等現(xiàn)象。

乳酸紙層析實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液、2%乳酸及空白培養(yǎng)液點(diǎn)在濾紙上，放入裝有展層劑（水-正丁醇-苯甲醇體積比為1∶5∶5）的層析缸，約10 h后，取出濾紙風(fēng)干。向?yàn)V紙均勻噴灑0.04%溴酚藍(lán)乙醇溶液顯色，對(duì)比樣品與乳酸所出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)位置，計(jì)算Rf值以判斷樣品中是否含有乳酸。

碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株接入各種碳水化合物培養(yǎng)試管，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察試管中培養(yǎng)物顏色變化及有無氣體產(chǎn)生。

1.3.2.4 菌株的16S rRNA分子鑒定

將篩選菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定16S rRNA序列。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵性能測(cè)定

將篩選出的耐酸、耐鹽、耐糖菌株進(jìn)行活化、擴(kuò)培后，按5%接種量分別接種于果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的生物量、活菌數(shù)、pH值、酸度等（自發(fā)酵始每隔3 h測(cè)定生物量、pH值和酸度，每隔12 h測(cè)定活菌數(shù)），每次測(cè)定重復(fù)3 次。

生物量：測(cè)定樣品在600 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)時(shí)間和OD600nm值繪制菌株生長(zhǎng)曲線；菌體干質(zhì)量：定量取5 mL菌體烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量計(jì)算；pH值：采用pH計(jì)直接測(cè)定；活菌數(shù)：采用伊紅美藍(lán)活菌數(shù)快速測(cè)定方法[27]測(cè)定；酸度（以乳酸濃度計(jì)）：采用酸堿滴定法測(cè)定[25,28]，具體步驟如下：吸取果蔬發(fā)酵液10 g，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定并邊滴定邊攪拌測(cè)定pH值，滴定至pH值為8.2，記錄標(biāo)準(zhǔn)NaOH用量，同時(shí)做空白對(duì)照，按式（2）計(jì)算發(fā)酵液酸度：

式中：C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mol/L）；V為滴定至pH 8.2時(shí)消耗的NaOH溶液的用量/mL；K為乳酸轉(zhuǎn)化系數(shù)，0.09；m為吸取發(fā)酵液體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖表采用Origin Pro 8.0進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選及形態(tài)學(xué)鑒定

在以溴甲基酚紫為指示劑的MRS分離培養(yǎng)基上，從蘋果樣品中分離出36 株變黃明顯，且具有乳酸菌典型菌落形態(tài)特征的菌株（圖1a）。其中有10 株產(chǎn)酸較強(qiáng)，菌株編號(hào)見表1，其菌體形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果見圖1b和表1。

圖1 MRS分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（a）和菌體形態(tài)（b）Fig. 1 Colony morphology (a) and bacterial morphology (b) on MRS medium

表1 菌落及菌體形態(tài)特征Table 1 Colony and bacterial morphology characteristics

溶鈣圈可以作為衡量產(chǎn)酸能力的重要指標(biāo)[25]。10 株疑似菌中有4 株在初篩培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生較大的溶鈣圈，表明這4 株菌耐酸能力強(qiáng)產(chǎn)酸多，將這4 株菌在含高鹽和高糖的復(fù)篩培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)僅有2 株生長(zhǎng)較好，能夠耐受高鹽高糖環(huán)境，這2 株菌分別為S3-10和R10。將這2 株菌分別接種于不同pH值（pH 2.0～3.0）、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.0%～10.0%）或葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10.0%～30.0%）的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行耐受性驗(yàn)證（表2），結(jié)果表明2 株菌的存活率都能保持在85%以上，均能耐受較低的pH值環(huán)境和高鹽、高糖環(huán)境。

表2 菌株耐受性實(shí)驗(yàn)的存活率Table 2 pH, NaCl and glucose tolerance (survival rate) of two strains%

2.2 乳酸菌生理生化鑒定

由表3可得，2 株菌在過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)等生化以應(yīng)均呈陰性。石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)中，2 株菌培養(yǎng)后使石蕊褪色，并且大量產(chǎn)酸使得牛乳凝固。乳酸紙層析實(shí)驗(yàn)中，2 株菌的發(fā)酵液與乳酸對(duì)照相比，Rf值相近，說明兩菌株發(fā)酵產(chǎn)物中含有乳酸。碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2 株菌對(duì)多種糖醇如葡萄糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、纖維二糖、甘露糖、半乳糖、核糖等都能夠利用，且發(fā)酵葡萄糖均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。這與前期有關(guān)乳酸菌糖醇利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[25,29]。

表3 菌株部分生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Partial physiological and biochemical properties of two strains

2.3 菌株16S rRNA鑒定

將篩選菌株S3-10和R10送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定16S rRNA序列。將測(cè)定的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)S3-10菌株與植物乳桿菌同源性高達(dá)99%。結(jié)合S3-10菌株的形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等表型鑒定結(jié)果，將S3-10菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，菌種保藏號(hào)CGMCC No.16750）。同理，將R10菌株鑒定為干酪乳桿菌（L. casei，菌種保藏號(hào)CGMCC No.16750）。

2.4 乳酸菌發(fā)酵性能分析

2.4.1 乳酸菌生長(zhǎng)情況分析

圖2 2 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線及活菌數(shù)變化Fig. 2 Growth curves and viable cell counts of two strains cultured on MRS medium

由圖2可知，2 株乳酸菌生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，均無延滯期，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在發(fā)酵20 h進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后生長(zhǎng)速率逐漸放慢并達(dá)到飽和。植物乳桿菌S3-10比干酪乳桿菌R10生長(zhǎng)速率略快，最終獲得的最大菌體干質(zhì)量S3-10為3.68 g/L，R10為3.49 g/L。發(fā)酵基質(zhì)中活菌數(shù)變化以映菌種利用發(fā)酵基質(zhì)性能的強(qiáng)弱[25]。圖2顯示，植物乳桿菌S3-10在發(fā)酵12 h時(shí)活菌數(shù)增加且在36 h之前活菌數(shù)均達(dá)到109CFU/mL，之后活菌數(shù)略有下降，但在84 h內(nèi)活菌數(shù)始終保持在108CFU/mL以上。干酪乳桿菌R10發(fā)酵活菌數(shù)變化趨勢(shì)與植物乳桿菌S3-10大體一致，但活菌數(shù)在發(fā)酵36 h后低于S3-10，發(fā)酵72 h內(nèi)活菌數(shù)保持在108CFU/mL。

圖3 2 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上發(fā)酵的pH值和酸度變化Fig. 3 Changes in pH and acidity of two strains cultured on MRS medium

發(fā)酵液中pH值的變化幅度也可以映菌株發(fā)酵性能的優(yōu)劣。pH值的降低不僅說明菌株對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的利用率高，還能影響一些不耐酸的微生物的生長(zhǎng)繁殖。如圖3所示，2 株乳酸菌的發(fā)酵過程中pH值的下降趨勢(shì)大致相似。發(fā)酵前期（前24 h）pH值下降迅速，這與發(fā)酵前期乳酸菌大量增殖有關(guān)；發(fā)酵后期，由于代謝產(chǎn)物、pH值等因素抑制，乳酸菌活菌數(shù)降低漸進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)pH值下降緩慢直至趨于穩(wěn)定，pH值分別達(dá)到2.15（S3-10）和3.0（R10）。植物乳桿菌S3-10 pH值下降速率明顯比干酪乳桿菌R10快，說明植物乳桿菌S3-10受條件抑制影響較小，生長(zhǎng)情況較好。酸度值是衡量菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力的重要指標(biāo)。由圖3可以看出，2 株乳酸菌酸度趨勢(shì)大致相同，在發(fā)酵10～36 h產(chǎn)酸速率最快，之后酸度增幅不大。植物乳桿菌S3-10酸度明顯高于干酪乳桿菌R10，最終發(fā)酵結(jié)束獲得的最大酸度約為35 μmol/L，是干酪乳桿菌R10產(chǎn)酸量的1.75 倍。

2.4.2 乳酸菌果蔬發(fā)酵性能分析

將2 株乳酸菌接入天然果蔬原漿中進(jìn)行發(fā)酵，由圖4可知，2 株乳酸菌無論在果蔬原料還是MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)趨勢(shì)均大致相同，接種后立即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在發(fā)酵24 h進(jìn)入穩(wěn)定期直至發(fā)酵結(jié)束。植物乳桿菌S3-10生長(zhǎng)速率仍略高于干酪乳桿菌R10，最終獲得的最大菌體干質(zhì)量S3-10為5.4 g/L，R10為5.08 g/L。對(duì)發(fā)酵液中活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果（圖4）表明，2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中均保持較高的活菌數(shù)，且活菌數(shù)變化趨勢(shì)大體一致。植物乳桿菌S3-10在發(fā)酵第12小時(shí)活菌數(shù)增加且在48 h之前活菌數(shù)均達(dá)到109CFU/mL，之后活菌數(shù)略有下降，但在72 h內(nèi)活菌數(shù)始終保持在108CFU/mL以上。干酪乳桿菌R10發(fā)酵活菌數(shù)在發(fā)酵24 h后略低于S3-10，發(fā)酵60 h內(nèi)活菌數(shù)保持在108CFU/mL。已有研究結(jié)果表明[19,30]，多數(shù)乳酸菌發(fā)酵果蔬24 h后活菌數(shù)明顯下降，且48 h就已降到105CFU/mL以下。而本研究所篩選的2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬均能保持較長(zhǎng)時(shí)間的高活菌數(shù)，更適用于果蔬汁的發(fā)酵。

圖4 2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中菌體干質(zhì)量及活菌數(shù)變化Fig. 4 Changes in dry cell mass and viable cell counts of two strains during fermentation of fruits and vegetables

圖5 2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中pH值和酸度變化Fig. 5 Changes in pH and acidity during fermentation of fruits and vegetables by two strains

混合果蔬原料中酸度、糖度相比于普通培養(yǎng)基都較高。如圖5所示，2 株乳酸菌在果蔬發(fā)酵過程中pH值的下降趨勢(shì)和產(chǎn)酸趨勢(shì)大致相似。發(fā)酵前期（前24 h）pH值下降迅速，之后pH值下降緩慢直至趨于穩(wěn)定，最終pH值分別達(dá)到2.81（S3-10）和2.98（R10）。已有研究結(jié)果表明[19,25,30]，多數(shù)乳酸菌發(fā)酵果蔬pH值變化趨勢(shì)和本研究一致，且發(fā)酵結(jié)束pH值均降到3左右。本研究pH值在24 h后即已降到3以下，而此時(shí)仍能保持較高的活菌數(shù)，說明這2 株乳酸菌受條件抑制影響較小。在發(fā)酵10～24 h產(chǎn)酸速率最快，之后酸度增幅不大。與MRS培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果相同，植物乳桿菌S3-10產(chǎn)酸量明顯高于干酪乳桿菌R10，最終發(fā)酵結(jié)束獲得的最大酸度約為22.6 μmol/L，是干酪乳桿菌R10酸度的1.26 倍。以上結(jié)果說明2 株乳酸菌對(duì)果蔬原料的利用率都較高，在果蔬發(fā)酵液中生長(zhǎng)良好。

3 結(jié) 論

本研究從沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿樣品中分離篩選出2 株具有良好的耐酸、耐鹽、耐糖特性的乳酸菌，經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定分別為植物乳桿菌S3-10和干酪乳桿菌R10。乳酸菌S3-10和R10均能較好地適應(yīng)果蔬發(fā)酵基質(zhì)，生長(zhǎng)繁殖旺盛、產(chǎn)酸速率快，其中植物乳桿菌S3-10生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量顯著高于干酪乳桿菌R10，在發(fā)酵果蔬汁、開發(fā)功能益生產(chǎn)品方面有更廣闊的應(yīng)用前景。植物乳桿菌和干酪乳桿菌是果蔬乳酸發(fā)酵的常用菌種，菌株S3-10和R10發(fā)酵果蔬性能優(yōu)異，可進(jìn)一步嘗試將2 株菌混合或與其他乳酸菌協(xié)同發(fā)酵果蔬原料，開發(fā)出營(yíng)養(yǎng)保健功能更強(qiáng)的果蔬汁或功能益生產(chǎn)品。