功能基因分析輔助篩選產(chǎn)雙乙酰和乙偶姻乳酸菌

楊 銘，郝曉娜，羅天淇，姜云蕓，楊貞耐，朱 宏，張 健,

（1.北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221）

發(fā)酵乳因其具有特殊的質(zhì)地、風味和緩解乳糖不耐癥等益生功能深受消費者歡迎，其中風味是消費者評價發(fā)酵乳的重要指標。發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)主要來源于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸和各種香氣化合物，這些化合物有的存在于牛乳本身中，也有的在發(fā)酵過程中產(chǎn)生[1]，其中雙乙酰是對發(fā)酵乳風味起決定性作用的化合物[2-3]。雙乙酰是在乳酸菌發(fā)酵和乳中檸檬酸代謝過程中產(chǎn)生的雙酮化合物[4]，可賦予乳制品特殊的奶油風味，乳酸乳球菌亞種中檸檬酸鹽對雙乙酰和乙偶姻途徑的作用已有相關(guān)研究報道[5-6]。乙偶姻與雙乙酰密切相關(guān)，也是存在于乳制品中具有奶油風味的物質(zhì)，通常乙偶姻的濃度可高于雙乙酰10～50 倍，但因雙乙酰的閾值較低，所以人們通常認為雙乙酰對乳制品風味的影響更大[7]。Milesi等[8]將高產(chǎn)雙乙酰和乙偶姻的干酪乳桿菌添加到發(fā)酵乳中可聞到濃郁的黃油味。

基因組注釋分析是一種快速、高通量功能性菌株篩選方法，被越來越廣泛地應(yīng)用于乳酸菌的優(yōu)良菌種選育和生理代謝機制的研究[9]。趙潔等[10]利用分子生物學的方法篩選出優(yōu)良產(chǎn)酸特性的菌株。Lo等[11]對13 種鼠李糖乳桿菌進行基因組分析和檸檬酸代謝關(guān)鍵酶基因重組，使菌株風味物質(zhì)產(chǎn)量大幅提高。傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品風味多樣，其中蘊藏著大量的高產(chǎn)風味物質(zhì)的乳酸菌。利用基因注釋分析技術(shù)篩選高產(chǎn)風味物質(zhì)乳酸菌對優(yōu)良菌株的發(fā)掘具有重要意義。

本研究以從內(nèi)蒙古奶豆腐和西藏靈菇中分離出的8 株乳酸菌為研究對象，在前期明確其發(fā)酵乳加工和風味改良特性基礎(chǔ)上[12-13]，通過全基因組測序，分析這些菌株代謝雙乙酰、乙偶姻等重要風味物質(zhì)的基因通路。采用氣相色譜-質(zhì)譜和化學分析方法定量檢測不同菌株發(fā)酵乳的風味物質(zhì)含量，分析風味物質(zhì)功能基因與關(guān)鍵風味物質(zhì)雙乙酰和乙偶姻產(chǎn)量間的關(guān)系，以期為篩選高產(chǎn)雙乙酰菌株和改良發(fā)酵乳的風味品質(zhì)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西藏靈菇：嗜熱鏈球菌（GST-6，本實驗室分離）、保加利亞乳桿菌（YNF-5，吉林省農(nóng)業(yè)科學院）、鼠李糖乳桿菌（5-1，本實驗室分離）、保加利亞乳桿菌（KW14-3，本實驗室分離）、植物乳桿菌（YW11，本實驗室分離）。

奶豆腐：副干酪乳桿菌（N1115，君樂寶）、植物乳桿菌（K25，吉林省農(nóng)業(yè)科學院）、乳酸乳球菌（XZ3303，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學）。

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、檸檬酸 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團有限公司；三氯乙酸、鄰苯二胺、濃鹽酸、氯仿、異戊醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21G III立式高速冷凍離心機、U3900紫外分光光度計 日本Hitachi公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器日本三洋公司；THZ-D電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器科技有限公司；固相微萃取手動進樣手柄、DVB-CARPDMS纖維頭（2 cm，50/30 μm） 美國Supelco公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

各菌株經(jīng)活化后（球菌使用M17培養(yǎng)基，其他使用MRS培養(yǎng)基），按5%（體積分數(shù)）接種量接種于10 mL 10%（質(zhì)量分數(shù)）的脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫發(fā)酵過夜后，以5%接種量轉(zhuǎn)接到50 mL脫脂乳培養(yǎng)基中，于37 ℃擴大培養(yǎng)，發(fā)酵至pH 4.5。

含檸檬酸脫脂乳培養(yǎng)基的制備：將檸檬酸晶體溶于去離子水，配制成10%溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌后，緩慢添加至滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，調(diào)檸檬酸終質(zhì)量分數(shù)為0.5%。

1.3.2 雙乙酰標準曲線的測定

參考康歡等[14]的方法。配制質(zhì)量濃度分別為0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0、21.0、24.0 μg/mL的雙乙酰標準溶液各20 mL，處理后使用紫外分光光度計測定335 nm波長處吸光度，繪制標準曲線。

1.3.3 雙乙酰含量檢測

采用鄰苯二胺法[15]，取發(fā)酵乳樣品20 mL，加入等體積的16%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液，混勻后于4 ℃、3 500×g離心10 min除蛋白，3M濾紙過濾上清液，使用紫外分光光度計在335 nm波長處測定上清液吸光度，利用標準曲線計算雙乙酰含量。

1.3.4 菌株基因組與功能基因的測定

將活化后的菌株發(fā)酵液于4 ℃、10 000×g離心20 min獲得細胞沉淀，使用氯仿-異戊醇方法提取DNA，提取的DNA由美吉生物公司進行基因組測定和序列數(shù)據(jù)整理。功能基因分析與注釋采用NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）線上分析完成，代謝通路分析采用KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）輔助完成。

1.3.5 乙偶姻及發(fā)酵乳風味物質(zhì)測定

參考王琪等[16]方法并稍加改動，采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測乙偶姻及發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)。

取6 g發(fā)酵乳樣品于20 mL萃取小瓶中，同時加入0.05 mL 1,2-二氯苯作為內(nèi)標物，將老化后的萃取頭插入密封的萃取小瓶中，于50 ℃頂空吸附30 min。

色譜條件：程序升溫：起始溫度30 ℃，保持5 min；以10 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持5 min。進樣口溫度240 ℃，載氣為氦氣。

質(zhì)譜條件：采用電子電離源，發(fā)射能量70 eV，離子源溫度250 ℃，發(fā)射電流100 μA。根據(jù)各風味物質(zhì)保留時間計算物質(zhì)保留指數(shù)，對標準庫和相關(guān)文獻對比，確定風味化合物種類，計算各風味化合物質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。應(yīng)用SigmaPlot 12.5軟件對發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)進行統(tǒng)計分析，主成分分析采用XLSTATE 12.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵乳雙乙酰產(chǎn)量分析

圖1 發(fā)酵乳的雙乙酰產(chǎn)量Fig. 1 Diacetyl contents of fermented milk samples

如圖1所示，在未添加檸檬酸的發(fā)酵乳樣品中，各組雙乙酰產(chǎn)量有顯著差異（P＜0.05），其中GST-6菌株所產(chǎn)雙乙酰質(zhì)量濃度最高，為0.72 μg/mL。其次菌株5-1、N1115雙乙酰產(chǎn)量分別為0.53、0.47 μg/mL。添加檸檬酸后，各組發(fā)酵乳中雙乙酰質(zhì)量濃度明顯升高，GST-6菌株發(fā)酵發(fā)酵乳中雙乙酰質(zhì)量濃度升高效果最為明顯，為6.23 μg/mL，可達未添加檸檬酸樣品的8.65 倍，這與丹彤等[17]在嗜熱鏈球菌發(fā)酵含檸檬酸酸奶產(chǎn)雙乙酰研究中的結(jié)論相符。菌株5-1、N1115雙乙酰質(zhì)量濃度也升高至5.28、4.47 μg/mL，分別為未添加檸檬酸樣品的9.96 倍和9.51 倍。說明檸檬酸是促進GST-6、5-1和N1115菌株產(chǎn)雙乙酰的重要因素。袁星星等[18]研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以以檸檬酸為碳源進行生長，產(chǎn)生具有奶油風味的雙乙酰，改善發(fā)酵乳等產(chǎn)品的風味。并且當某些乳酸菌的生長速率不再提高時，仍可以利用檸檬酸代謝產(chǎn)生雙乙酰等風味物質(zhì)[19]。

2.2 菌株產(chǎn)雙乙酰和乙偶姻相關(guān)基因的注釋與分析

圖2 乳酸菌中雙乙酰和乙偶姻合成途徑Fig. 2 Synthesis pathways of diacetyl and acetoin in lactic acid bacteria

表1 合成雙乙酰關(guān)鍵基因的注釋Table 1 Annotations of key genes related to synthesis of diacetyl

為分析菌株風味相關(guān)基因與雙乙酰和乙偶姻等關(guān)鍵風味物質(zhì)間的關(guān)系，研究首先對8 株菌的基因組進行基因注釋分析，并參考Chen Chen等[20]和Cheng Hefa[21]繪制了乳酸菌雙乙酰和乙偶姻合成的主要途徑（圖2）。如圖2和表1所示，乳酸菌合成雙乙酰的主要途徑有兩條，一是由葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成丙酮酸，再由丙酮酸代謝產(chǎn)生雙乙酰，另一途徑是由檸檬酸裂解酶形成草酰乙酸鹽，再經(jīng)草酰乙酸脫羧酶的作用生成丙酮酸，從而促進雙乙酰的合成。兩種代謝途徑中都以丙酮酸為中間代謝產(chǎn)物，后續(xù)以應(yīng)再以丙酮酸為起點最后可形成不同香氣活性物質(zhì)[22]。當未向發(fā)酵乳中添加檸檬酸時，產(chǎn)雙乙酰的兩種途徑共同作用，但產(chǎn)生量較少；向發(fā)酵乳中添加檸檬酸后，檸檬酸產(chǎn)生雙乙酰的途徑被大大加快，雙乙酰的產(chǎn)量也隨之顯著升高。增加雙乙酰的積累量，要求菌株中必需物質(zhì)為OAD和ALS，這兩種物質(zhì)可以促進檸檬酸代謝轉(zhuǎn)化為雙乙酰。而LDH促進丙酮酸分解為乳酸，PFL促進丙酮酸轉(zhuǎn)化為醋酸，ALDB會使α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻，這3 種基因通路會減少雙乙酰的產(chǎn)量。DR會將已經(jīng)形成的雙乙酰分解成乙偶姻，不利于雙乙酰的積累。Ricciardi等[23]研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌可通過呼吸作用改變丙酮酸轉(zhuǎn)化途徑，使OAD、ALS基因和ALDB基因表達上調(diào)，LDH基因和PFL基因表達下調(diào)，有利于雙乙酰等揮發(fā)性成分的形成。

2.3 菌株雙乙酰、乙偶姻產(chǎn)量與相關(guān)功能基因的關(guān)聯(lián)分析

為研究菌株基因組中風味相關(guān)功能基因的有無及其數(shù)量對風味物質(zhì)產(chǎn)量的影響，采用關(guān)聯(lián)分析方法分析功能基因與風味產(chǎn)量間的關(guān)系。本研究選用擬合分析，參考Acosta-Pech等[24]和Covarrubias-Pazaran[25]根據(jù)不同來源樣品進行基因組分析的統(tǒng)計模型。依據(jù)菌株的功能基因信息建立菌株功能基因圖譜，并轉(zhuǎn)換為數(shù)量矩陣，以菌株含有的基因數(shù)量賦值，不含有的基因賦值為0，將各基因、雙乙酰和乙偶姻含量進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果如圖3所示，可知各基因和雙乙酰含量符合正態(tài)分布，故在關(guān)聯(lián)分析時選用Pearson相關(guān)分析。其中ALDB基因和DR基因在8 種菌株中沒有差異，不參與分析。

圖3 雙乙酰、乙偶姻產(chǎn)量與相關(guān)功能基因的正態(tài)分布分析Fig. 3 Normal probability plot of diacetyl and acetoin production and levels of related functional genes

表2 雙乙酰、乙偶姻產(chǎn)量與相關(guān)功能基因的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis between diacetyls and acetoin production and related functional genes

R絕對值代表該基因與雙乙?；蛞遗家霎a(chǎn)量的相關(guān)程度。R為正時表現(xiàn)為正相關(guān)，R為負時表現(xiàn)為負相關(guān)；R＞0.5，具有相關(guān)性，R＞0.8，強相關(guān)。如表2所示，雙乙酰和乙偶姻均與PFL基因的關(guān)聯(lián)不大，起到主要作用的為OAD基因。在未添加檸檬酸發(fā)酵乳的雙乙酰關(guān)聯(lián)分析中，ALS基因相關(guān)系數(shù)值僅為0.346，且P＞0.05，表明統(tǒng)計上的關(guān)聯(lián)度不高，OAD基因的相關(guān)系數(shù)為0.898，說明該基因?qū)﹄p乙酰的貢獻較大（P=0.015）。并且LDH基因與ALS基因、OAD基因為負相關(guān)，表明LDH基因可能會減少雙乙酰產(chǎn)量。菌株添加檸檬酸發(fā)酵的雙乙酰關(guān)聯(lián)分析中，ALS基因的相關(guān)系數(shù)有所上升，并且OAD基因相關(guān)系數(shù)增大為0.916，表明其對雙乙酰產(chǎn)量的貢獻顯著增強（P=0.010）。這可能與檸檬酸刺激了檸檬酸代謝產(chǎn)雙乙酰的通路，使經(jīng)過此條通路產(chǎn)生的雙乙酰量顯著升高有關(guān)[17]。乙偶姻產(chǎn)量與各功能基因的相關(guān)程度略差，且顯著性分析P＞0.05，表明乙偶姻的合成可能較為復(fù)雜，現(xiàn)有數(shù)據(jù)和功能基因信息上無法有效預(yù)測。

2.4 發(fā)酵乳氣相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果

表3 氣相色譜-質(zhì)譜檢測藏靈菇發(fā)酵乳風味物質(zhì)分析Table 3 Contents of volatile flavor components in yoghurt determined by GC-MS

為進一步明確菌株對發(fā)酵乳風味的整體影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測各菌株發(fā)酵乳的揮發(fā)性化合物組成，如表3所示。共檢測到24 種揮發(fā)性風味化合物，酮類7 種，醛類3 種，酸類8 種，酯類2 種，其他揮發(fā)性物質(zhì)4 種。不同菌株發(fā)酵乳的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量差異較大，植物乳桿菌K25菌株發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最多，有16 種；而保加利亞乳桿菌YNF-5菌株發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最少，有11 種。

本實驗共檢出7 種酮類化合物，其中5-1、K25、N1115檢測出6 種酮類化合物。酮類化合物可通過不飽和脂肪酸氧化、氨基酸降解和熱降解途徑產(chǎn)生[26]。此類物質(zhì)閾值較低，對發(fā)酵乳的風味貢獻較大。2-庚酮產(chǎn)生于亞油酸氧化過程，可賦予發(fā)酵乳強烈的果香[27]。乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）是由α-乙酰乳酸脫羧形成的，也可由雙乙酰分解產(chǎn)生，因此與發(fā)酵乳中雙乙酰的含量有重要關(guān)系。在YNF-5、KW14-3發(fā)酵乳中未檢測到乙偶姻，可能是因為這兩種菌株中不含產(chǎn)雙乙酰的關(guān)鍵基因OAD和ALS。K25發(fā)酵乳中的乙偶姻質(zhì)量濃度較高，為8.59 μg/mL。2-壬酮可賦予發(fā)酵乳甜香、果香及奶油氣味；2-十一烷酮有蠟香、脂肪香，并伴有奶油、乳酪的味道[28]。

醛類化合物是構(gòu)成發(fā)酵乳典型香氣的重要組分，其閾值一般較低，是各種氧化風味的來源[29]。本次檢出的主要為壬醛、糠醛和苯甲醛。壬醛具有蠟香和脂肪香[28]。苯甲醛在8 種樣品中均被檢出，據(jù)報道苯甲醛有類似水果和堅果一樣香氣，可使發(fā)酵乳更加清香柔和[30]。這3 種醛類物質(zhì)在劉東等[31]對天祝牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵白牦牛發(fā)酵乳風味特性的分析也有檢出。

酸類化合物是發(fā)酵乳中的重要風味化合物，乳酸也是發(fā)酵乳中的主要滋味的來源。本實驗共檢出6 種酸類化合物，其中乙酸、丁酸、己酸和辛酸在8 種樣品中均有檢出。丁酸、己酸、辛酸為牛乳本身具有的風味脂肪酸物質(zhì)，乙酸可表現(xiàn)為醋酸味，丁酸可賦予發(fā)酵乳奶酪的香氣[32]，己酸有脂肪氣味，辛酸有水果的微酸香氣。戊酸僅在KW14-3發(fā)酵乳中檢出，可在一定程度上提高發(fā)酵乳的奶油香氣。癸酸有增加發(fā)酵奶香的作用。但酸類化合物對發(fā)酵乳更主要的作用體現(xiàn)在滋味上，可使發(fā)酵乳具有清香爽滑的口感[33]。

醇類物質(zhì)的閾值普遍較高，對發(fā)酵乳風味的作用不大。但醇類物質(zhì)可在一定情況下轉(zhuǎn)化為酸類物質(zhì)，所以醇類物質(zhì)也是發(fā)酵乳中一種重要的化合物。在8 種樣品共檢出乙醇和2-呋喃甲醇兩種醇類物質(zhì)。乙醇僅在YW11和XZ3303發(fā)酵乳中存在，它主要由藏靈菇中的酵母菌無氧代謝產(chǎn)生。2-呋喃甲醇僅在5-1發(fā)酵乳中檢出，這種醇類主要由乳中的脂肪酶降解脂肪酸產(chǎn)生，具有甜香[34]。

酯類化合物主要來源于牛乳中的脂肪酸水解和微生物的代謝過程。本實驗中共檢出兩種酯類物質(zhì)，都僅在N1115發(fā)酵乳中檢出。酯類物質(zhì)可使發(fā)酵乳含有水果香氣[35]。在適當質(zhì)量濃度下，酯類物質(zhì)可調(diào)和發(fā)酵乳的氣味及口感，影響發(fā)酵乳的整體風味。

本實驗還檢測出了甲苯、二氫-2-甲基-3(2H)-噻吩、二甲砜和D-檸檬烯，它們在不同的樣品中被檢測到，這可能與乳酸菌種間的差異有關(guān)。各種風味化合物通過協(xié)同作用等可構(gòu)成發(fā)酵乳的整體風味。

圖4 發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)的主成分分析Fig. 4 PCA of volatile components in yogurts fermented by the 8 LAB strains

為明確不同揮發(fā)性風味物質(zhì)對菌株整體風味構(gòu)成的貢獻，采用主成分分析法研究發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味物質(zhì)對樣品整體風味構(gòu)成的貢獻，結(jié)果如圖4所示。主成分1、2的累計貢獻率為86.24%，其中酮類的主成分貢獻率為14.25%，醛類對風味的貢獻率為4.57%，酸類對風味的貢獻率為71.27%，酯類為3.83%，其他為6.08%。根據(jù)各風味物質(zhì)在樣品射線上投影的長短可知，對各菌株發(fā)酵乳揮發(fā)性風味貢獻度較大的主要為酸類，包括乙酸、丁酸、己酸和辛酸等。另外，2-庚酮和2-壬酮對各樣品的風味也有較大貢獻，而乙偶姻和雙乙酰將樣品從主成分1軸中間分為上下兩組，水平中線上方為樣品鼠李糖乳桿菌5-1、副干酪乳桿菌N1115、嗜熱鏈球菌GST-6和植物乳桿菌K25，除菌株K25外，其他3 株菌的雙乙酰和乙偶姻產(chǎn)量均較高。植物乳桿菌K25為何有如此高乙偶姻產(chǎn)量還有待進一步研究。水平中線下方為植物乳桿菌YW11、保加利亞乳桿菌KW14-3和YNF-5、乳酸菌乳球菌XZ3303，這些菌株的雙乙酰和乙偶姻產(chǎn)量較低。揮發(fā)性風味物質(zhì)中的有機酸、乙偶姻和雙乙?？赡苁切纬删晏卣餍燥L味的主要原因。

3 結(jié) 論

檢測8 株乳酸菌在發(fā)酵乳中雙乙酰、乙偶姻等風味物質(zhì)的產(chǎn)量，篩選出嗜熱鏈球菌GST-6、鼠李糖乳桿菌5-1和副干酪乳桿菌N1115三株高產(chǎn)雙乙酰菌株（P＜0.05）。全基因組注釋與關(guān)聯(lián)分析顯示，8 株乳酸菌的雙乙酰產(chǎn)量與PFL基因的關(guān)聯(lián)不大，起到主要作用的為OAD基因。乙偶姻產(chǎn)量與功能基因的關(guān)聯(lián)度較差。氣相色譜-質(zhì)譜法共檢測到24 種揮發(fā)性風味化合物，有機酸、乙偶姻和雙乙?？赡苁菂^(qū)分菌株發(fā)酵乳特征性風味的主要物質(zhì)。2-庚酮和2-壬酮對各樣品的揮發(fā)性風味也有較大貢獻。