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    混菌發(fā)酵鴨腿工藝優(yōu)化及其貯藏品質(zhì)特性

    2020-06-01 04:07:20阮一凡潘道東孫楊贏田宏偉湯曉艷
    食品科學(xué) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵劑亞硝酸鹽菌種

    阮一凡,潘道東,,孫楊贏,田宏偉,湯曉艷

    (1.寧波大學(xué) 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315800;2.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315800;3.湖北周黑鴨企業(yè)發(fā)展有限公司,湖北 武漢 430040;4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

    肉類發(fā)酵自古以來就作為肉類的保存方式,最早的記錄可以追溯到公元前1 500年。隨著時(shí)間的推移,不同的地理區(qū)域開發(fā)出了不同大小、形狀、質(zhì)地、外觀和風(fēng)味的獨(dú)特肉類產(chǎn)品[1]。到19世紀(jì)中葉,人們認(rèn)識到細(xì)菌、酵母和霉菌在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的重要性,最終發(fā)酵過程才得到規(guī)范[2]?,F(xiàn)在的發(fā)酵肉制品是通過益生菌發(fā)酵得到的具有獨(dú)特風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值高、易消化、具有保健功效的一類產(chǎn)品[3],也因其具有水分活度低等優(yōu)勢,能很好地長期保藏。而且由于發(fā)酵肉制品中的微生物作用,能夠把營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子風(fēng)味物質(zhì)或者是易消化吸收的成分[4]。

    鴨肉因其具有良好的口感和味道,廣受消費(fèi)者喜愛,同時(shí)鴨肉還具有低脂肪、低膽固醇等優(yōu)點(diǎn),在當(dāng)今崇尚健康飲食消費(fèi)中備受歡迎[5]。添加發(fā)酵劑與肉制品中,可以起到抑制有害菌生長、縮短生產(chǎn)周期、改善產(chǎn)品色澤及風(fēng)味的作用,從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[6]。國內(nèi)外已有將發(fā)酵劑應(yīng)用于食品提升產(chǎn)品品質(zhì)的研究。張洵[7]使用植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母菌改良發(fā)酵魚糜,得到的產(chǎn)品具有良好的理化性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味;Palavecino等[8]用清酒乳桿菌分別與小牛葡萄球菌和木糖葡萄球菌混合,制作出兩組香腸進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩組香腸的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值都不同程度顯著低于未接菌組。說明選擇正確的發(fā)酵劑添加到肉中,會對肉的感官風(fēng)味品質(zhì)、安全性能等都有很大的幫助。

    發(fā)酵肉制品在貯藏過程中,由于受到原料質(zhì)量、pH值、微生物、酶、溫度、濕度和時(shí)間等因素的影響,也存在一些潛在的安全隱患,比如亞硝酸鹽和生物胺的積累,在適宜條件下會形成致癌物亞硝基化合物[9];雖然脂肪氧化有益于風(fēng)味的產(chǎn)生,但是過度的氧化會產(chǎn)生毒素,危害人體健康,而且一般發(fā)酵肉制品都具有較高的脂肪含量,所以也極易發(fā)生脂肪過度氧化[10];最后還有病原菌和霉菌毒素的產(chǎn)生等[11],它們既會影響產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值,更重要的是會危害到人體健康。譚李紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌和木糖葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵能夠降低發(fā)酵香腸中生物胺含量;胡永金[13]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和干酪乳桿菌接種比例為1∶1∶1時(shí),加入魚糜中可有效抑制腸道菌等雜菌及致病菌的生長繁殖,降低生物胺和揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)累積,提高發(fā)酵制品的生物安全性。所以發(fā)酵劑的使用可以有效延長發(fā)酵肉制品的貯藏期,提高安全品質(zhì)。

    本研究以鴨腿肉為原料,通過對接菌量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行發(fā)酵鴨腿的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),確定其最佳工藝配比,并對終產(chǎn)品的大腸桿菌、過氧化值、亞硝酸鹽和組胺含量進(jìn)行測定,確定其安全性。然后對發(fā)酵鴨腿成品貯藏過程中感官評價(jià)、菌落總數(shù)、亞硝酸鹽含量、TBARS值、TVB-N值及生物胺的變化進(jìn)行測定,以期為發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品貯藏品質(zhì)變化提供參考及理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    櫻桃谷鴨腿、香辛料及輔料為當(dāng)?shù)厥惺郏恢参锶闂U菌、釀酒酵母菌為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

    亞硝酸鹽、抗壞血酸、葡萄糖(均為食品級)寧波航景生物科技有限公司;MRS培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖(yeast peptone dextrose,YPD)瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;丹磺酰氯、色胺、苯乙胺等生物胺標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司;甲醇、乙腈、丙酮均為色譜純;氯仿、高氯酸、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氨水等均為分析純;真空包裝袋(70 mm×100 mm,厚度0.08 mm) 中國廣東佛山市雙福包裝有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Infinite 200 pro全波長掃描多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司;1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 江蘇蘇州凈化設(shè)制有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;H1850R冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HSW型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 浙江寧波江南儀器廠;XHF-D高速分散器 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 發(fā)酵鴨腿的制作工藝

    1.3.1.1 發(fā)酵劑制備

    活化好的植物乳桿菌取1%接入MRS肉湯中,于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h;釀酒酵母菌接種環(huán)挑出單菌落,接入YPD培養(yǎng)基,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后,取出菌液按所需比例混合,8 000 r/min、4 ℃高速冷凍離心10 min后用無菌生理鹽水洗滌,重復(fù)3 次,收集菌體,最后用無菌生理鹽水稀釋得到所需液體發(fā)酵劑。

    1.3.1.2 生產(chǎn)配方

    參考王萍萍等[14]方法,稍作修改。按1 kg肉質(zhì)量計(jì),食鹽1.5%,亞硝酸鈉0.010%,抗壞血酸0.08%,蔗糖1.5%,葡萄糖1%,味精0.2%,白胡椒粉0.08%,料酒4.0%,花椒0.15%,洋蔥粉0.2%,生抽6.5%。

    1.3.1.3 工藝流程及主要步驟

    工藝流程:原料鴨腿→腌制料→4 ℃、24 h冷藏腌制→添加發(fā)酵劑→發(fā)酵→煮制→真空包裝→殺菌→成品。

    步驟:原料鴨腿:從市場挑選剛宰后新鮮鴨腿(均質(zhì)量約為250 g),洗凈血水,用刀背輕敲并且割開幾個(gè)小口,方便調(diào)料入味;腌制:按1.3.1.2節(jié)配方依次加入輔料與肉混勻,于4 ℃冷藏腌制24 h;添加發(fā)酵劑:將接種量為106CFU/g的發(fā)酵劑與腌制好的肉混勻;發(fā)酵:將混勻好的鴨腿吊掛在恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi),在一定的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間條件下,相對濕度50%;蒸制:將發(fā)酵好的鴨腿于沸水上方蒸制30~35 min,即得到發(fā)酵鴨腿成品;包裝:待冷卻后進(jìn)行真空包裝;貯藏:成品于常溫(20 ℃左右)貯藏。

    1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.2.1 接菌量對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

    接菌量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,菌種配比1∶1的植物乳桿菌-釀酒酵母菌加入肉料中,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

    1.3.2.2 發(fā)酵劑菌種配比對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

    接菌量選取1.3.2.1節(jié)最佳條件,植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、3∶2、2∶1進(jìn)行接種,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

    1.3.2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

    接菌量選取1.3.2.1節(jié)最佳條件,植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比選取1.3.2.2節(jié)最佳條件加入肉料中,發(fā)酵溫度分別為24、27、30、33、36、39 ℃,發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

    1.3.2.4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

    接菌量、發(fā)酵劑菌種配比和發(fā)酵溫度均選取上述最優(yōu)條件,發(fā)酵時(shí)間分別為6、12、18、24、30、36 h。測定成品的感官評分和pH值。

    1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以感官評分和pH值為檢測指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

    1.3.4 感官評定

    邀請10 名消費(fèi)者(固定)參照GB 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》[15],對發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品的顏色、黏度、彈性、氣味進(jìn)行評價(jià),以能否檢測出感官的不可接受為最低標(biāo)準(zhǔn),確定產(chǎn)品感官可接受性。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

    表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

    1.3.5 pH值的測定

    參照Aro等[16]的方法,略有修改。取10 g樣品剪碎,加入90 mL蒸餾水,勻漿6×10 s,過濾,用pH計(jì)測定濾液的pH值。

    1.3.6 終產(chǎn)品理化指標(biāo)測定

    1.3.6.1 大腸桿菌的測定

    參照GB 4789.38—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》[17]方法進(jìn)行測定。

    1.3.6.2 亞硝酸鹽的測定

    按南京建成生物研究所試劑盒的方法進(jìn)行測定。

    1.3.6.3 過氧化值的測定

    參照GB/T 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[18]方法進(jìn)行測定。

    1.3.6.4 組胺的測定

    參考白婷[4]的方法進(jìn)行測定:超聲處理(功率300 W,溫度45 ℃)2 min,6 000 r/min離心5 min。取1.0 mL鹽酸提取液,置于10 mL離心管中,再加入1 mL水后加氫氧化鈉溶液呈堿性;后續(xù)方法采用GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》[19]進(jìn)行測定。

    1.3.7 貯藏期指標(biāo)測定

    1.3.7.1 菌落總數(shù)的測定

    參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[20]的方法進(jìn)行測定。

    1.3.7.2 TBARS值的測定

    參照Witte等[21]的方法,略有修改。取10 g鴨腿肉絞碎,向里加入50 mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1%乙二胺四乙酸),在冰浴中以10 000 r/min勻漿6×10 s,然后過濾。取5 mL上清液,加入5 mL 0.02 mo1/L TBARS溶液,于沸水浴中保溫40 min,取出冷卻后再以5 000 r/min離心5 min,上清液取出后加入等體積氯仿混勻,靜置分層后,吸取上層清液,分別測定在532 nm和600 nm波長處的吸光度(A),并按下式計(jì)算TBARS值:

    1.3.7.3 TVB-N值的測定

    參考GB/T 5009.44—2003[15]的方法對各組鴨肉樣品中的TVB-N含量進(jìn)行測定。

    1.3.7.4 生物胺的測定

    參照Tasi?等[22]和朱志遠(yuǎn)[23]的方法,并稍作修改。

    標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品制成1 mg/mL儲備液備用。用0.4 mol/L高氯酸溶液將以上標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配成終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。鋁箔避光、-20 ℃冰箱保存。

    樣品處理:取5 g絞碎肉樣加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸溶液,冰浴勻漿,5 000 r/min、4 ℃離心10 min取上清液,沉淀用上述方法再提取1 次。合并2 次提取的上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容到50 mL。

    標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的衍生化:取1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液使之呈堿性,接著加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖,然后加入2 mL的丹磺酰氯溶液(10 mg/mL,溶劑為色譜級丙酮,現(xiàn)配現(xiàn)用),于40 ℃水浴中暗以應(yīng)處理30 min后加入100 μL的氨水中止以應(yīng),去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5 mL,0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,用于分析檢測。取1 mL的樣液如標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生。

    色譜條件:Agilent ZORBAX XDB-C18以相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣體積20 μL,紫外檢測波長254 nm;流動相:水(A相)、乙腈(B相)、0.1 mol/L乙酸銨(C相);洗脫程序見表2。

    表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 21軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差及顯著性分析(Duncan多重比較),統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平設(shè)定為0.05,用Origin 8.1軟件作圖,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 接菌量的選擇

    圖1 接菌量對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of inoculum amount on the quality of fermented duck thigh

    由圖1可看出,隨著接菌量的增加,發(fā)酵鴨腿的感官評分值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,pH值則逐漸下降,在接菌量2%和2.5%時(shí)差異不顯著(P>0.05)。在接菌量為2%時(shí),達(dá)到最大值82 分。原因可能是隨著發(fā)酵劑的量增多,經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味化合物增多,使發(fā)酵鴨腿口感品質(zhì)較好。但添加過多的發(fā)酵劑后,其發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)物,比如乳酸產(chǎn)生過多,導(dǎo)致產(chǎn)品pH值過低,影響產(chǎn)品接受度。綜合感官評分和pH值,選擇接菌量2%為最適條件。

    2.1.2 發(fā)酵劑菌種配比的選擇

    圖2 菌種配比對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of inoculum composition on the quality of fermented duck thigh

    由圖2可知,當(dāng)植物乳桿菌比例不變,隨著釀酒酵母菌比例的增加,感官評分變化不顯著,pH值逐漸上升。當(dāng)比例為2∶3時(shí),感官評分最高為83 分,說明植物乳桿菌對于感官評分的影響較大,而此時(shí)產(chǎn)品pH值為5.27。而當(dāng)比例為3∶2時(shí),感官評分下降,可能是因?yàn)槿樗峋^多,產(chǎn)生乳酸降低了pH值,影響口感,而此時(shí)pH值最低為4.75。所以選擇菌種配比2∶3為最佳。

    2.1.3 發(fā)酵溫度的選擇

    圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented duck thigh

    由圖3可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵鴨腿的感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,pH值逐漸降低,因?yàn)闇囟仍礁?,發(fā)酵會越快,pH值降低越顯著。隨著溫度緩慢升高,感官評分的變化不顯著,當(dāng)溫度在33 ℃時(shí)達(dá)到最大,然后開始下降,可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度升高,加速了脂肪的氧化,油脂味重影響口感。所以選取發(fā)酵溫度33 ℃為最適條件。

    2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的選擇

    圖4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on the quality of fermented duck thigh

    由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長,前期感官評分上升趨勢快,在12~18 h期間差異不顯著,而后在第24小時(shí)感官評分達(dá)到最大值,然后隨著時(shí)間的延長緩慢下降,差異不顯著。而pH值在6~12 h和18~24 h差異不顯著(P>0.05),后期隨著時(shí)間的延長則逐漸減少??赡艿脑蚴乔捌诎l(fā)酵時(shí)間太短導(dǎo)致發(fā)酵不徹底,沒有形成很好的風(fēng)味。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,乳酸菌與酵母菌相互作用,產(chǎn)生良好的風(fēng)味物質(zhì)。但時(shí)間過長也可能造成乳酸的積累導(dǎo)致風(fēng)味不佳,后續(xù)感官評分逐漸下降。所以,選取發(fā)酵時(shí)間24 h為最適條件。

    2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Minitab17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,以菌種配比(A)、發(fā)酵溫度(B)、接菌量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)作為4 個(gè)考察因素,選取3 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)并對結(jié)果進(jìn)行極差分析,以確定最佳工藝條件。

    表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design in terms of coded and actual data with experimental results

    由表3可知,感官評分最優(yōu)水平為A3B2C3D2;而低pH值有利于產(chǎn)品保存,所以最優(yōu)水平為A3B2C3D3。感官評分4 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋航泳浚–)>發(fā)酵溫度(B)>菌種配比(A)>發(fā)酵時(shí)間(D),說明接菌量作用最大;而pH值4 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋航泳浚–)>發(fā)酵溫度(B)>發(fā)酵時(shí)間(D)>菌種配比(A),也說明混合發(fā)酵劑的接菌量直接影響產(chǎn)品的pH值。選擇表3中感官評分最高和pH值較小的A2B2C3D1與上述A3B2C3D2和A3B2C3D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表4所示。

    表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of validation experiments

    由表4可知,A3B2C3D2感官評分最高,但與A2B2C3D1的差異不顯著(P>0.05),而A2B2C3D1組的pH值雖高于A3B2C3D3,但高質(zhì)量發(fā)酵產(chǎn)品pH值應(yīng)控制在4.7~5.2之間[4],此時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)品既有利于產(chǎn)品保存,又不會因?yàn)檫^酸影響口感。所以最后確定A2B2C3D1為最優(yōu)工藝組合,即菌種(植物乳桿菌-釀酒酵母菌)配比1∶2、發(fā)酵溫度30 ℃、接菌量2.0%、發(fā)酵時(shí)間24 h。

    2.3 發(fā)酵鴨腿理化指標(biāo)測定結(jié)果

    表5 發(fā)酵鴨腿理化指標(biāo)Table 5 Physicochemical indicators of fermented duck thigh

    pH值是發(fā)酵肉制品的一個(gè)重要指標(biāo),高質(zhì)量的發(fā)酵產(chǎn)品pH值應(yīng)控制在4.7~5.2之間[4]。此時(shí)的產(chǎn)品才能達(dá)到抑制腐敗菌生長,改善產(chǎn)品色澤、質(zhì)構(gòu),降低亞硝酸鹽殘留量的效果,從而保證產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量穩(wěn)定性[24]。由表5可知,此時(shí)接菌發(fā)酵的產(chǎn)品pH值為5.02,既滿足了消費(fèi)者對酸度的接受范圍,也對產(chǎn)品的安全性有了保障。大腸桿菌作為判斷發(fā)酵香腸安全性的重要指標(biāo)之一,根據(jù)國家對發(fā)酵肉制品的要求是小于30 MPN/100 g,終產(chǎn)品中未檢出大腸桿菌,因?yàn)榘l(fā)酵劑特別是乳酸菌的生長可以抑制致病菌的生成。過氧化值直接以映了脂肪氧化的程度,乳酸菌會生成乳酸從而降低pH值,當(dāng)pH值小于7時(shí),脂肪氧化的程度會隨著pH值的升高而增強(qiáng)[25],所以終產(chǎn)品脂肪氧化程度低。亞硝酸鹽作為腌制劑添加到肉中,但乳酸菌可以一定程度促進(jìn)亞硝酸鹽分解,降低其含量。組胺作為毒性最強(qiáng)的生物胺,一直在發(fā)酵肉制品中備受關(guān)注,因?yàn)榘l(fā)酵肉制品的蛋白含量普遍較高,隨著加工和貯藏時(shí)間的延長,容易生成生物胺。由于發(fā)酵時(shí)間短,產(chǎn)品組胺沒有檢出。

    2.4 貯藏期指標(biāo)測定結(jié)果

    2.4.1 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

    菌落總數(shù)測定用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量,以映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求,以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價(jià)[26]。根據(jù)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn):一級鮮肉,細(xì)菌總數(shù)≤104CFU/g;二級鮮肉,細(xì)菌總數(shù)≤106CFU/g;三級鮮肉,細(xì)菌總數(shù)≤107CFU/g;腐敗肉,細(xì)菌總數(shù)>108CFU/g。

    圖5 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 5 Changes in total plate count during storage of fermented duck thigh

    由圖5可知,貯藏初期接菌組菌落總數(shù)為3.46(lg(CFU/g)),且接菌組數(shù)量明顯高于對照組,這可能是因?yàn)橥匀话l(fā)酵相比,接種的發(fā)酵劑中含有植物乳桿菌及釀酒酵母菌。接菌組鴨腿的菌落總數(shù)在貯藏過程中呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢,從第0天的3.46(lg(CFU/g))上升到第20天的4.42(lg(CFU/g)),之后開始下降,到第50天為3.22(lg(CFU/g)),且40 d和50 d沒有顯著差異,可能是間隔時(shí)間短,菌落總數(shù)變化量不大。

    貯藏初期,乳酸菌可以在真空環(huán)境中生長并可耐鹽,逐漸成為優(yōu)勢菌群,成為平板菌落計(jì)數(shù)中的主要組成[27]。隨著時(shí)間的延長,微生物彼此的競爭作用以及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,導(dǎo)致微生物的生長繁殖受到抑制,表現(xiàn)為菌落總數(shù)的減少[28]。據(jù)報(bào)道,貯藏后期乳酸菌對有害雜菌的抑制效果更顯著[29]。

    2.4.2 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中感官評分的變化

    圖6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中感官評分的變化Fig. 6 Changes in sensory score during storage of fermented duck thigh

    由圖6可知,第0天接菌組的感官評分為84.7,不接菌組的感官評分為79.66。在貯藏過程中接菌兩組發(fā)酵鴨腿的產(chǎn)品感官評分逐漸降低,但是接菌發(fā)酵組的評分一直高于不接菌組。而且不接菌組的發(fā)酵鴨腿在第20天時(shí)感官評分為61.71,在第30天已經(jīng)低于60 分,鴨肉已經(jīng)散發(fā)出不好的腐敗氣味,從菌落總數(shù)指標(biāo)也可以看出,在第30天時(shí),不接菌組的菌落總數(shù)已經(jīng)大于106CFU/g,所以這種不好聞的氣息可能來源于微生物引起的質(zhì)量劣變,影響了感官評分,后續(xù)沒有對不接菌的鴨腿進(jìn)行感官的評分。而接菌組在第50天感官評分仍為67.54。

    2.4.3 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中亞硝酸鹽的變化

    圖7 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig. 7 Changes in nitrite content during storage of fermented duck thigh

    如圖7所示,在貯藏期間發(fā)酵鴨腿的亞硝酸鹽含量在第20天達(dá)到最大值,隨后逐漸減少。而不接菌發(fā)酵鴨腿在貯藏過程中持續(xù)增加,但50 d內(nèi)亞硝酸鹽含量始終低于30 mg/kg,符合GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。

    在常溫下,微生物活動活躍,以引起食物腐敗的G+細(xì)胞(如肉毒核狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等)腐敗菌繁殖加快,產(chǎn)生毒素導(dǎo)致蛋白質(zhì)易分解,蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的胺類物質(zhì)。此時(shí)形成的亞硝胺數(shù)量更多,從而不接菌組的亞硝酸鹽含量會持續(xù)增加[30]。而接菌組中的乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢菌群從而抑制腐敗菌的生成,所以會抑制亞硝酸鹽的生成。

    2.4.4 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TBARS值的變化

    TBARS值越大,脂肪氧化的程度越高,產(chǎn)生的小分子物質(zhì)如酮、醛、酸類等物質(zhì)越多,因而產(chǎn)品的腐敗越嚴(yán)重[31]。產(chǎn)品中TBARS值在0.5~1.0 mg/kg時(shí)不會產(chǎn)生腐敗氣味,小于1.0 mg/kg的產(chǎn)品是可以接受的[32]。據(jù)報(bào)道[33],TBARS值達(dá)到1~2 mg/kg以上就已腐敗變質(zhì)。

    圖8 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TBARS值的變化Fig. 8 Changes in thiobarbituric acid content during storage of fermented duck thigh

    由圖8可知,隨著貯藏時(shí)間的延長,接菌組發(fā)酵鴨腿的TBARS值從初始的0.49 mg/kg逐漸增加至第50天的0.63 mg/kg,增長的幅度較小,可能是真空環(huán)境以及發(fā)酵鴨腿在制作過程中使用亞硝酸鹽、異抗壞血酸鈉和發(fā)酵劑的共同作用。而且因?yàn)橹参锶闂U菌可以產(chǎn)生乳酸,導(dǎo)致pH值的下降,抑制脂肪的氧化,所以接菌處理對TBARS具有抑制作用。與本實(shí)驗(yàn)相似的研究結(jié)果也表明,成熟風(fēng)干香腸在長期真空貯藏(7 個(gè)月)期間,TBARS值只略有上升[34]。而不接菌組從初始的0.65 mg/kg到1.27 mg/kg,在第30天的含量已經(jīng)高達(dá)0.85 mg/kg,說明接種發(fā)酵劑可顯著影響并延緩發(fā)酵鴨腿的脂質(zhì)氧化。

    2.4.5 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TVB-N值的變化

    肉品中TVB-N值隨著貯藏時(shí)間的延長而增高[35]。TVB-N值小于15 mg/100 g為一級鮮度,在15~20 mg/100 g之間為二級鮮度,大于20 mg/100 g為變質(zhì)肉[36]。

    圖9 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TVB-N值的變化Fig. 9 Changes in TVB-N content during storage of fermented duck thigh

    由圖9可知,接菌組發(fā)酵鴨腿TVB-N值從初始2.61 mg/100 g到50 d的14.98 mg/100 g,不接菌組從初始的2.30 mg/100 g到50 d的34.02 mg/100 g,TVB-N值在整個(gè)貯藏過程中持續(xù)增加,但接菌組中TVB-N值增加緩慢,且都低于15 mg/100 g。結(jié)果表明,接種混合發(fā)酵劑可有效抑制TVB-N的生成,提高發(fā)酵香腸的衛(wèi)生質(zhì)量。與Yang等[37]結(jié)果相似。同時(shí)Talon等[38]也發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過降低pH值抑制雜菌和致病菌的生長,阻止雜菌利用游離氨基酸等含氮化合物產(chǎn)生揮發(fā)性含氮成分。

    2.4.6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中生物胺含量的變化

    在貯藏的前期,接菌組的生物胺含量大多高于不接菌組,這可能是因?yàn)樯锇肥窃谖⑸镒饔孟掠捎坞x氨基酸作為前體物合成的,而且游離氨基酸作為營養(yǎng)物可促進(jìn)微生物生長,其中就有生物胺形成菌,這些菌能直接加快生物胺的積累[39]。因此,游離氨基酸的存在與生物胺的積累呈正相關(guān),這與之前游離氨基酸的測定結(jié)果吻合[4]。生物胺混標(biāo)色譜見圖10。

    圖10 生物胺混標(biāo)色譜圖Fig. 10 Chromatograms of mixed standard solution of biogenic amines

    美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定食品中生物胺總量不得超過1 000 mg/kg,其中組胺含量≤50 mg/kg,酪胺含量≤100 mg/kg[40]。如表6所示,除尸胺外,其他接菌組的生物胺都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,而不接菌組的生物胺含量一直呈現(xiàn)出上升趨勢。通過發(fā)酵為生物胺的形成創(chuàng)造了適當(dāng)條件,包括微生物生長和蛋白質(zhì)水解。在貯藏前期,微生物的存在及發(fā)酵產(chǎn)品成熟過程中微生物脫羧酶的殘留活性,水解形成的游離氨基酸作為胺的潛在前體,都會增加生物胺含量[34]。從圖5可以看出,從30 d開始菌落總數(shù)開始下降,有研究表明,生物胺的減少可能與微生物數(shù)量的減少有關(guān),尤其是乳酸菌含量[41],所以證明貯藏后期生物胺含量的下降。細(xì)菌在貯藏期間的生長受到貯藏溫度、含氧量、氯化鈉含量等的影響。而由于大部分與組胺產(chǎn)生有關(guān)的細(xì)菌為嗜溫菌[42],所以前期沒有組胺產(chǎn)生,而后期產(chǎn)生可能是因?yàn)槭覝叵陆M胺易形成[4]。而接菌組的生成組胺含量少于不接菌組,說明混菌發(fā)酵可以有效控制發(fā)酵肉中組胺的積累,這也與Tsai等[43]的結(jié)論相似。

    表6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中各生物胺的含量Table 6 Changes in biogenic amines contents during storage of fermented duck thighmg/kg

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的基礎(chǔ)上,引入新的發(fā)酵工藝制備發(fā)酵鴨腿,并研究其品質(zhì)特性的變化規(guī)律,得到的發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品發(fā)酵風(fēng)味濃郁,品質(zhì)良好。通過對接菌量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間這4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),得到發(fā)酵鴨腿的最佳工藝條件為接菌量2%、植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比1∶2、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h,通過對此工藝下制作的發(fā)酵產(chǎn)品pH值、大腸桿菌、亞硝酸鹽、組胺和過氧化值測定,得到產(chǎn)品的指標(biāo)均在國家標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi),說明此工藝條件下制得的發(fā)酵鴨腿具有較高的感官評分和較好的安全性。在常溫貯藏過程中,真空包裝的發(fā)酵鴨腿其菌落總數(shù)和亞硝酸鹽含量呈先增加后降低的趨勢,TBARS值和TVB-N值始終在緩慢增加,整體的變化范圍較小。酪胺、精胺與腐胺是貯藏期間檢出的主要胺類物質(zhì),接菌組生物胺含量在貯藏期間的后期有所下降,不接菌組生物胺含量初期較低,后期持續(xù)升高。不接菌組于30 d因微生物質(zhì)量劣變引起不好的風(fēng)味,而接菌組將產(chǎn)品貯藏期延長至50 d。所以添加混合發(fā)酵劑能夠提升產(chǎn)品口感和延長產(chǎn)品貯藏期,為新型發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新的方向和理論指導(dǎo)。

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