基于高通量測序技術分析蜂糧微生物多樣性

劉玥佳，韓業(yè)君，彭文君，牛慶生，方小明，趙亞周，田文禮,

（1.中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.中國科學院過程工程研究所，北京 100190；3.吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林 吉林 132013）

蜂糧是蜜蜂將蜂花粉、蜂蜜、蜜蜂分泌物等充分混合，經特定微生物充分發(fā)酵后，貯存于巢房中供蜜蜂食用的物質。其營養(yǎng)豐富、風味獨特，是一種極具開發(fā)潛力的發(fā)酵食品[1]。由于從蜂群中直接獲取量少且非常繁瑣，理想的方式是實現(xiàn)離群、工業(yè)化生產，而制約工業(yè)化生產的因素眾多，其中關鍵是發(fā)酵微生物的確定。對于研究食品中微生物的群落組成及變化，常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法費時、費力，且無法真正解析微生物的組成、豐度及其變化情況。高通量測序技術可省去培養(yǎng)過程，直接從樣品中提取微生物基因組DNA后進行測序分析，結合生物信息學工具，能夠檢測出傳統(tǒng)方法無法分離培養(yǎng)的微生物[2-3]。蜂糧發(fā)酵過程中的菌群一直處于動態(tài)變化中，因此，利用高通量測序技術研究和分析不同發(fā)酵周期的蜂糧菌群構成及其演替規(guī)律，具有重要的理論意義和潛在的實用價值。

目前，在食品領域中已有大量將高通量測序技術用于微生物群落分析的研究[4-6]，例如對干酪、韓國泡菜[7]等發(fā)酵食品中微生物群落結構的分析，揭示了發(fā)酵食品釀造過程中微生物群落結構、豐度變化及其與代謝產物之間的聯(lián)系。蜂糧中菌群豐富，包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌等，但關于蜂糧的菌群結構研究還比較少。劉賽[8]從蜂糧中分離純化出39 株菌株，并從這些菌株中篩選出了3 株產酸性能較好的乳酸菌，經鑒定分別為：Lactobacillus plantarum、L. casei ssp. casei、L. debrueckii ssp. delbrueckii。Gilliam[9]從人工采集花粉、蜜蜂采集蜂花粉以及貯存在蜂箱中1、2、6 周的（蜂糧）花粉中分離出了6 個屬，113 種酵母菌。此外，花粉中大部分的酵母菌種在蜂糧中并未發(fā)現(xiàn)，這說明蜂糧釀制過程中酵母菌群發(fā)生了變化。張言周等[10]從蜂糧樣品中分離出產芽孢的細菌，經鑒定分別隸屬于Lysinibacillus fusiformis、Bacillus tequilensis、Fictibacillus nanhaiensis、B. aerophilus、B. invictus、B. sonorensis、L. xylanilyticus、B. methylotrophicus等芽孢桿菌；崔學沛[11]從意蜂蜂糧中篩選得到了B. amyloliquefaciens和B. licheniformis。Gilliam等[12]從蜂糧樣品中分離出了曲霉菌、青霉菌和毛霉菌等霉菌。蘇松坤[13]從不同釀制時期的蜂糧中亦分離出了曲霉菌、青霉菌和毛霉菌等霉菌，由于花粉源植物和地區(qū)的不同，其含量存在一定差異。

目前，通常把蜂糧的發(fā)酵過程分為4 個階段：1）異源微生物生長階段；2）厭氧發(fā)酵起始階段；3）酸化階段；4）穩(wěn)定階段[14]。開始的0.5 d，花粉中營養(yǎng)物質豐富，乳酸菌和酵母菌大量繁殖。約在發(fā)酵開始7 d以后，基質內pH值達到4.0～4.5，高濃度的乳酸抑制乳酸菌和酵母菌等的生長，某些乳酸菌和酵母菌開始消失，蜂糧釀制完成[15]。乳酸菌在發(fā)酵第0.5天時豐度最高，發(fā)酵第4天時豐度下降，7 d以后乳酸菌含量下降明顯。

卡尼鄂拉蜂（Apis mellifera carnica）采蜜能力強，范圍廣，故本研究以卡尼鄂拉蜂的蜂糧為研究對象，采用Illunina MiSeq高通量測序平臺對細菌的16S rDNA V4-V5區(qū)進行測序，分析蜂糧的微生物群落多樣性及各類微生物的構成及變化，明確蜂糧發(fā)酵過程中的優(yōu)勢，為人工蜂糧的生產提供理論依據(jù)，以期更好地提高蜂糧品質，推動其產業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品采集于吉林省養(yǎng)蜂科學研究所。采集方法：首先，取樣的第1天，蜂箱中只保留一張大幼蟲脾外，其他脾全部抽出，加一張育過5～6 代蜜蜂的空脾（事先用75%乙醇溶液噴灑消毒）；用隔王柵將蜂王限制在子脾上，使工蜂給空脾裝花粉。5 h后將花粉脾抽出，均勻選取位于巢脾不同位置的蜂糧樣品收集于離心管（已滅菌）中，樣品采集完后置于-80 ℃冰箱凍存。10 h后取下多用器蓋板，第2天早上再蓋回。同時在寄放花粉脾的蜂群內加一張大花粉脾供蜂群食用[16]。按照上述方法依次取得發(fā)酵0.5、4、7、12 d的蜂糧樣品。

PowerSoil DNA Isolation Kit （Cat# 12888-50）試劑盒 上海斯信生物科技有限公司；膠回收試劑盒德國Qiagen公司。

1.2 儀器與設備

ME104E精密天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；Haier磁力攪拌器 常州邁科諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂糧樣品總DNA提取

由于每個巢房內可獲取的蜂糧樣品較少，將若干個巢房的蜂糧樣品混勻進行DNA提取以提高DNA濃度，同時使蜂糧樣品更具代表性。參照DNeasy PowerSoil Kit（Cat# 12888-50）試劑盒說明，分別提取不同發(fā)酵時間蜂糧細菌基因組DNA。所得DNA采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3.2 蜂糧16S rRNA基因V4-V5區(qū)的擴增

利用瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA進行初步檢測，即取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式以應（polymerase chain reaction，PCR）測定。

1.4 蜂糧高通量測序和數(shù)據(jù)分析

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；切下目的條帶并用膠回收試劑盒回收。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司基于Illumina MiSeq技術測序平臺構建文庫，進行高通量雙末端測序。

得到下機數(shù)據(jù)后利用Barcode序列和PCR擴增引物序列進行拆分，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH[17]對每個樣本的reads進行拼接，得到的原始Tags數(shù)據(jù)需要經過嚴格的過濾處理[18]得到高質量的Tags數(shù)據(jù)。參照QIIME（Version 1.9.1）[19]的Tags質量控制流程，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用UPARSE軟件（UPARSE v7.0.1001）[20]對所有樣本的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），篩選出現(xiàn)頻率最高的OTUs序列作為代表序列。用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA方法將篩選到的OTUs序列進行物種注釋并根據(jù)其分類學信息在各分類水平上進行分類統(tǒng)計，分析各個樣本的群落組成[21-22]。

使用QIIME軟件（Version 1.9.1）計算Observed-OTUs、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，并進行α多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 蜂糧樣品總DNA的提取

提取蜂糧基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA完整性，結果如圖1所示，可進行后續(xù)測序。

圖1 蜂糧細菌基因組DNA提取Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA samples extracted from bee bread

2.2 蜂糧發(fā)酵過程中細菌群落的α多樣性分析

利用稀釋曲線評價蜂糧菌群的測序深度和物種豐富度。從圖2可以看出，隨著測序深度增加，稀釋曲線基本達到飽和，說明樣本的測序數(shù)據(jù)量足以以應蜂糧中的微生物多樣性。

每個樣品的Coverage指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。Coverage指數(shù)以映了樣本的真實情況，Coverage指數(shù)越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低；Chao1指數(shù)是群落豐度指數(shù)，Chao1指數(shù)越大，表明樣品微生物群落豐度越高；Shannon指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，表明樣品微生物多樣性越高；OTUs數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度[23]。由表1可知，不同發(fā)酵周期的蜂糧中微生物Coverage指數(shù)都大于0.99，說明樣品文庫中序列基本上都被測出，即樣本測序結果可以以映樣品的真實情況。隨著發(fā)酵時間的延長，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)先升高后降低，發(fā)酵中期，物種豐富度達到最高。由圖3可知，4 個樣品共得到429 個OTUs，不同發(fā)酵周期共有OTUs數(shù)為99，各個時期獨有的OTUs數(shù)相對較少。

圖2 蜂糧測序樣品稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of bee bread

表1 α多樣性指數(shù)Table 1 α Diversity indices of different samples

圖3 OTUs分布Venn圖Fig. 3 Venn diagram showing the distribution of OTUs

2.3 蜂糧菌群多樣性

2.3.1 基于門分類水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖4 蜂糧菌群基于門分類水平的分布Fig. 4 Bacterial distribution at the phylum level

如圖4所示，高通量測序分析表明蜂糧菌群主要由軟壁菌門（Tenericutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、（Acetothermia）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、生氧光細菌門（Oxyphotobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）等組成。隨著發(fā)酵時間的延長，基于門水平的微生物多樣性發(fā)生了變化。

不同發(fā)酵周期的蜂糧在門分類水平上，優(yōu)勢菌門所占比例相似，生氧光細菌和變形菌的含量最高，為優(yōu)勢菌群。發(fā)酵時間為0.5、4、7、12 d的蜂糧中生氧光細菌和變形菌的含量分別為：90.2%、89.0%、85.6%、92.2%；1.7%、4.2%、5.6%、1.5%。

衣原體門（C hla m y dia e）、梭桿菌門（Fusobacteria）、泉古菌門（Crenarchaeota）在發(fā)酵初期含量比較少，而在發(fā)酵4、7、12 d的蜂糧樣品中均未檢測出，可能是來自于蜂花粉，隨著發(fā)酵的進行，加上蜜蜂的轉化，這幾種菌逐漸消失。Calditrichaeota、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在發(fā)酵0.5、4、7 d的蜂糧中均未檢測出，而在發(fā)酵12 d的蜂糧中少量存在，說明其產生于蜂糧的發(fā)酵后期。

2.3.2 基于綱分類水平的蜂糧菌群多樣性分析

如圖5所示，高通量測序分析表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭菌綱（Clostridia）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、桿菌綱（Bacilli）、Nitrososphaeria、unidentified Actinobacteria、酸微菌綱（Acidimicrobiia）等組成。隨著發(fā)酵時間的延長，基于綱水平的微生物群落結構發(fā)生了變化。Nitrososphaeria和Acidimicrobiia在發(fā)酵第0.5天和12天時均為0，僅在發(fā)酵中期存在。

蜂糧中主要的菌群為生氧光細菌門Oxyphotobacteria，在蜂糧中占到了80%以上，但其只鑒定到了門分類水平，無法具體鑒定到門以下水平，可能是現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中關于此類菌群的信息較少，所以序列沒有得到高相似度的16S DNA比對結果。

2.3.3 基于目水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖6 蜂糧菌群基于目分類水平的分布Fig. 6 Bacterial distribution at the order level

如圖6所示，測序結果表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、unidentified Alphaproteobacteria、擬桿菌目（Bacteroidales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、梭菌目（Clostridiales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、unidentified Gammaproteobacteria、立克次氏體目（Rickettsiales）、互營桿菌目（Syntrophobacterales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）等組成。這些菌均出現(xiàn)于整個發(fā)酵周期。

2.3.4 基于科水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖7 蜂糧菌群基于科分類水平的分布Fig. 7 Bacterial distribution at the family level

如圖7所示，測序結果表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、醋桿菌科（Acetobacteraceae）、unidentified Alphaproteobacteria、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、（Muribaculaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、unidentified Rickettsiales、unidentified Gammaproteobacteria、互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）等組成。

2.3.5 基于屬水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖8 蜂糧菌群基于屬分類水平的分布Fig. 8 Bacterial distribution at the genus level

如圖8所示，共鑒定出112 個屬：在發(fā)酵0.5 d的蜂糧中共鑒定出46 個屬，4 d的蜂糧中鑒定出個69 個屬，7 d的蜂糧中鑒定出77 個屬，12 d的蜂糧中鑒定出47 個屬，其中4 個樣品中有25 個共有菌屬。

基于屬水平，蜂糧最優(yōu)勢微生物為unidentified Oxyphotobacteria，隨著發(fā)酵的進行，unidentified Oxyphotobacteria受到抑制，發(fā)酵中期減少，發(fā)酵后期又增加。但unidentified Oxyphotobacteria始終是優(yōu)勢菌。此外，玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、unidentified Alphaproteobacteria、不動桿菌屬（Acinetobacter）、熱硫還原桿菌屬（Thermodesulforhabdus）、unidentified Gammaproteobacteria、短波單胞菌屬（Brevundimonas）均呈先增加后減少的趨勢，與unidentified Oxyphotobacteria基本一致。unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。Gammaproteobacteria正是蜜蜂腸道的八大菌群；Stenotrophomonas、Sphingobacterium、Anaerobiospirillum、Odoribacter、Rhodococcus、Bacteroides、Geothermobacter、Calorithrix、Anaeromyxobacter在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵后期才存在，說明這些菌產生于蜂糧的發(fā)酵后期；還有一些菌，如unidentified Gammaproteobacteria、念珠菌（Candidatus）、Nitrosopelagicus、SUP05 cluster、Candidatus Actinomarina、unidentified Bacteria、unidentifiedRhodospirillales、unidentifiedThermoplasmata、弧形菌屬（Vibrio）、Puniceispirillum、Aquibacter、嗜熱彎曲甲烷熱桿菌（Methanothermobacter）、Limnobacter、瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）等在發(fā)酵初期和末期均不存在，只存在于發(fā)酵中期。

3 討 論

由于每個巢房內可挖取的蜂糧樣品較少，小于0.1 g，進行DNA提取的濃度太低，無法建庫進行后續(xù)測序，故參考Vigneron等[24]的實驗方法，每次取樣時均勻選取位于巢脾不同位置的蜂糧樣品，將若干個巢房的蜂糧樣品混勻，進行DNA的提取以提高DNA濃度，同時可以使蜂糧樣品更具代表性。

對不同發(fā)酵時間的蜂糧中的細菌種群結構和多樣性變化的研究表明，隨著發(fā)酵的進行，細菌物種多樣性和豐富度先升高后降低。但主要優(yōu)勢微生物并沒有改變，始終為生氧光細菌和變形菌，生氧光細菌是蜂糧中豐度最高的菌群。unidentified Oxyphotobacteria在發(fā)酵過程中豐度一直最高，為發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢菌。

近年來，科研人員基于16S rRNA序列和宏基因組分析技術，對不同地區(qū)的西方蜜蜂的腸道菌群進行了檢測，結果顯示有95%以上都屬于8大類群，分別是Gilliamella、Gammaproteobacteria、Snodgrassella、Bartonella、Acetobacteraceae、Lactobacillus、Lactobacillus acidophilus、Bifidobacterium[25-33]。本研究中發(fā)現(xiàn)的unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria在發(fā)酵第1天時均未被檢出，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。

Gilliamella、Lactobacillus、Bartonella、Bifidobacterium等幾種菌在蜂糧樣品中均被檢出。Gilliamella與Bifidobacterium均在第7天的樣品中含量最高；Lactobacillus在發(fā)酵初期含量最高，而后一直呈下降趨勢；Bartonella在發(fā)酵末期含量最高。Engel等[34]對西方蜜蜂腸道菌群宏基因組的分析發(fā)現(xiàn)：其腸道菌可能有多種功能，例如與宿主相互作用，形成生物膜，分解碳水化合物等，對病原菌的防御和免疫起著至關重要的作用。

Engel等[35]通過對Bartonella進一步分析發(fā)現(xiàn)：Bartonella含有VB12的合成系統(tǒng)，可以合成VB12供給蜜蜂；此外，Bifidobacterium、Lactobacillus和Gilliamella還具有合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶等功能。而果膠纖維素是花粉內壁的主要成分，果膠降解酶的合成表明這些菌群有助于蜂花粉釋放營養(yǎng)物質。這些潛在的功能也從基因水平上以映了乳酸菌可能參與了蜜蜂體內碳水化合物的代謝。

4 結 論

本實驗通過對卡尼鄂拉蜂不同發(fā)酵時間的蜂糧進行高通量測序，分析和研究了蜂糧發(fā)酵過程中細菌群落的組成及其豐度變化，考察不同發(fā)酵時間對蜂糧發(fā)酵過程中菌群的影響，共27 個門、112 個屬的細菌被鑒定出?；陂T水平，Oxyphotobacteria和Proteobacteria是優(yōu)勢菌群。基于屬水平，蜂糧最優(yōu)勢微生物為unidentified Oxyphotobacteria，隨著發(fā)酵的進行，unidentified Oxyphotobacteria受到抑制，發(fā)酵中期減少，發(fā)酵后期又增加，但unidentified Oxyphotobacteria始終是優(yōu)勢菌。生氧光細菌與光合作用有關[36]，從而推斷本實驗的優(yōu)勢菌unidentified Oxyphotobacteria可能與植物的光合作用有關，說明這種菌有可能來自于花粉源植物。此外，一些菌如unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria等，在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。進一步驗證了Mattila等[37]認為蜂糧中的菌群一部分來自于蜜蜂腸道菌群的研究結果。

蜂糧中主要的菌群為生氧光細菌門Oxyphotobacteria，在蜂糧中占到了80%以上，但其只鑒定到了門分類水平，無法具體鑒定到門以下水平，可能是現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中關于此類菌群的信息較少，所以序列沒有得到高相似度的16S DNA比對結果。研究結果對于蜂糧中該類微生物的分離鑒定具有重要意義。本研究為實現(xiàn)蜂糧工業(yè)化生產過程中發(fā)酵菌株的確定及發(fā)酵條件確定、進一步篩選優(yōu)勢發(fā)酵菌株提供一定的參考依據(jù)。