酸脅迫對S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影響及其生理機(jī)制

王大慧，徐若烊，黎德超，衛(wèi)功元

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）均為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的重要活性含硫小分子化合物，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。SAM具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫基等作用，參與體內(nèi)基因調(diào)控、神經(jīng)傳導(dǎo)以及解毒等多種生理過程[1-2]，GSH具有提高機(jī)體免疫力和抗氧化等功能，在臨床醫(yī)藥、運動保健和食品加工等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

酵母發(fā)酵法是合成SAM和GSH最常用的方法[5-6]。在酵母細(xì)胞中，SAM由L-甲硫氨酸和ATP經(jīng)SAM合成酶催化合成[7]；而GSH由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶催化的序貫以應(yīng)合成[8]。同時，SAM和GSH的生物合成均需要ATP參與，胞內(nèi)ATP的供給水平是決定SAM和GSH能否過量合成的重要因素[9]。本實驗組分別通過誘變育種[10]、添加前體氨基酸[11]和能量輔助物質(zhì)[12]、過量表達(dá)外源基因[13]和敲除線粒體膜相關(guān)基因[14]，提高了胞內(nèi)SAM和GSH的含量，實現(xiàn)了分批發(fā)酵過程中SAM和GSH的聯(lián)合高產(chǎn)。SAM和GSH均屬于胞內(nèi)物質(zhì)，細(xì)胞密度的增加將有助于二者聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量的提高。因此，有必要考察高密度培養(yǎng)條件下的SAM和GSH生物合成情況及其影響因素。

在食品發(fā)酵工業(yè)中，許多微生物在代謝過程中會遭遇到酸脅迫環(huán)境，對酸脅迫也有一定的抵抗和適應(yīng)能力[15-16]。不同微生物對外界酸脅迫環(huán)境的響應(yīng)情況不盡相同，導(dǎo)致不同代謝產(chǎn)物在生物合成中所需的最適pH值也會有很大的差異[17]。近年來，隨著微生物抗逆性相關(guān)的生理機(jī)制被逐漸解析，酸脅迫處理也開始應(yīng)用于微生物代謝產(chǎn)物的過量合成[18]。在以往針對產(chǎn)朊假絲酵母分批發(fā)酵的研究中，發(fā)現(xiàn)pH 5.0有利于細(xì)胞生長和SAM合成[19]，弱酸脅迫（pH 3.5）有助于胞內(nèi)GSH含量的提升[20]，而強(qiáng)酸脅迫（pH 1.5）則明顯抑制了細(xì)胞的正常代謝[21]。然而，目前還不清楚酸脅迫對高密度培養(yǎng)條件下的產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH過程將產(chǎn)生的影響。為此，本研究比較不同pH值條件下的產(chǎn)朊假絲酵母高密度培養(yǎng)過程，重點考察酸脅迫環(huán)境對酵母細(xì)胞合成SAM和GSH能力的影響，并對酸脅迫的作用機(jī)制進(jìn)行解析，以期為深入理解產(chǎn)朊假絲酵母生理特性以及提高SAM和GSH生物合成能力拓展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis Δpor1），由蘇州大學(xué)微生物生理與代謝調(diào)控研究室篩選并保藏[14]。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L；pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L，(NH4)2SO410 g/L，KH2PO412.3 g/L，L-甲硫氨酸4.6 g/L，CaCl20.05 g/L，MgSO40.05 g/L；pH值根據(jù)實驗要求確定。流加培養(yǎng)基：葡萄糖600 g/L，(NH4)2SO4100 g/L，KH2PO4123 g/L，L-甲硫氨酸46 g/L，CaCl20.5 g/L，MgSO40.5 g/L；葡萄糖單獨滅菌后與其他成分混合。

1.2 儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；HZ-2010KA恒溫?fù)u瓶柜 太倉市華利達(dá)實驗儀器設(shè)備有限公司；J6-MI型冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；UV2300 II雙光束紫外-可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 高密度培養(yǎng)

將種子液接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%（V/V），起始轉(zhuǎn)速350 r/min，通氣量3.0 L/min。為實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，自第12小時起以多項式流加方式補(bǔ)加流加培養(yǎng)基至總糖質(zhì)量濃度為200 g/L（至約28 h），具體流加操作方法見文獻(xiàn)[22]。通過手動調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速（300～900 r/min）將溶氧水平控制在不低于30%。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，并通過流加3 mol/L H2SO4溶液或3 mol/L NaOH溶液將pH值控制在實驗要求的范圍內(nèi)。

1.3.3 無細(xì)胞提取物的制備

取5 mL發(fā)酵液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，得到的酵母細(xì)胞經(jīng)生理鹽水洗滌2 次后，再重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液（即無細(xì)胞提取物），用于測定胞內(nèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度和關(guān)鍵酶活性。

1.3.4 指標(biāo)測定

細(xì)胞干質(zhì)量和葡萄糖質(zhì)量濃度的測定參考文獻(xiàn)[4]。

胞內(nèi)SAM的提取和測定[10]：取10 mL新鮮發(fā)酵液，3 500 r/min離心10 min，濕細(xì)胞用0.35 mol/L稀硫酸溶液萃取2 h，離心，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得的樣品采用HPLC法測定SAM質(zhì)量濃度。

GSH的提取和測定[23]：取10 mL新鮮發(fā)酵液，3 500 r/min離心10 min，濕細(xì)胞在30 ℃用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液萃取2 h，離心，取上清液采用DTNB-谷胱甘肽還原酶循環(huán)法定量測定GSH質(zhì)量濃度。

胞內(nèi)NADH、NAD+、ATP和ADP質(zhì)量濃度的測定采用HPLC法[11]。

1.3.5 酶活性測定

SAM合成酶（蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyltransferase，MAT））活性的測定方法參見文獻(xiàn)[12]。

γ-GCS、己糖激酶（hexose kinase，HK）、ATP合成酶、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量均采用南京建成生物科技有限公司的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活性采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒進(jìn)行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.6 發(fā)酵過程參數(shù)計算

胞內(nèi)SAM和GSH含量、細(xì)胞得率、SAM和GSH得率、細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度、SAM和GSH生產(chǎn)強(qiáng)度等發(fā)酵過程參數(shù)的計算方法見文獻(xiàn)[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以3 組平行樣品檢測結(jié)果的 ±s表示，差異顯著性檢驗以pH 5.0組作為對照組，用t檢驗雙尾檢驗分析。Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程分析

圖1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程Fig. 1 Time courses of high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditions

在前期分批發(fā)酵研究[18-21]的基礎(chǔ)上，重點考察酸脅迫環(huán)境對高密度培養(yǎng)條件下產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH的影響。為此，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別控制在2.5（強(qiáng)酸脅迫）、3.5（弱酸脅迫），并以pH 5.0（適合生長）作為對照。不同pH值條件下的葡萄糖消耗、細(xì)胞生長、SAM和GSH合成情況見圖1，SAM和GSH產(chǎn)量、含量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度等發(fā)酵過程參數(shù)的最大值見表1?？梢钥闯?，酵母細(xì)胞能在較寬的pH值范圍內(nèi)利用葡萄糖進(jìn)行生長并達(dá)到較高的細(xì)胞密度，但是在pH 2.5和pH 3.5條件下的最大細(xì)胞干質(zhì)量分別比pH 5.0時的水平下降10.1%和8.1%。綜合細(xì)胞得率和生產(chǎn)強(qiáng)度等過程參數(shù)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞在酸脅迫環(huán)境下的生長代謝明顯受到了一定程度的抑制。

表1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程參數(shù)Table 1 Parameters involved in high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditions

與細(xì)胞生長情況不同，pH 3.5有利于SAM和GSH的生物合成（圖1），胞內(nèi)SAM和GSH含量分別比pH 5.0時的結(jié)果高出17.1%和20.9%，最終SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量也提高了10.4%。表1中SAM、GSH得率和生產(chǎn)強(qiáng)度等結(jié)果也證明了pH 3.5可以促進(jìn)SAM和GSH在酵母細(xì)胞內(nèi)的合成和積累。然而，在pH 2.5條件下，酵母細(xì)胞的SAM和GSH合成能力明顯下降，SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量、得率、生產(chǎn)強(qiáng)度等指標(biāo)均低于pH 5.0條件下的結(jié)果。由此可見，弱酸脅迫可以提高SAM和GSH的合成能力，而強(qiáng)酸脅迫則對酵母細(xì)胞的代謝過程產(chǎn)生了不利的影響。以下將對酸脅迫在高密度聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵中的作用機(jī)制進(jìn)行解析。

2.2 SAM和GSH合成關(guān)鍵酶活性

MAT和γ-GCS分別是SAM和GSH生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[7-8]，圖2結(jié)果表明，在同一pH值條件下，細(xì)胞生長期間（前36 h）的MAT活性均維持在相對穩(wěn)定的水平，而在高密度培養(yǎng)后期（48、60 h）MAT的活性有所提高，但幅度不大。與此同時，γ-GCS活性在細(xì)胞生長期逐漸增加，至36 h達(dá)到最大值，之后逐漸降低。圖2還表明，在任一培養(yǎng)階段，pH 3.5時的MAT和γ-GCS活性均高于pH 2.5和pH 5.0時的活性，表明弱酸脅迫環(huán)境有利于將SAM和GSH生物合成關(guān)鍵酶的活性維持在較高水平。

圖2 不同pH值條件下的MAT和γ-GCS活性Fig. 2 Activities of MAT and γ-GCS under different pH conditions

2.3 能量代謝物質(zhì)合成關(guān)鍵酶活性

HK和IDH分別是糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，在好氧發(fā)酵中，其活性的大小對胞內(nèi)葡萄糖消耗和NADH形成速率均能產(chǎn)生重要的影響[9]。由圖3可以看出，不同pH值環(huán)境下的酵母胞內(nèi)HK活性均在18 h達(dá)到較高的水平，此時pH 3.5和pH 5.0條件下的HK活性相差不大。此外，在葡萄糖流加期間，IDH基本不受pH值環(huán)境和培養(yǎng)時間的影響，其活性一直維持在較為穩(wěn)定的水平；至第30小時，IDH活性雖然有所提高，但不同pH值條件下的結(jié)果沒有明顯差異。綜合30 h前的HK和IDH活性結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，pH 3.5和pH 5.0環(huán)境比pH 2.5更加有利于底物的消耗，并促進(jìn)NADH的合成與供給。

為研究酵母胞內(nèi)ATP的合成是否受pH值的影響，檢測不同培養(yǎng)階段ATP合成酶的活性，結(jié)果如圖4所示。可以看出，pH 2.5條件下的ATP合成酶活性一直維持在較低水平，且不同培養(yǎng)時間下的酶活性沒有明顯差異，而在pH 3.5和pH 5.0時，流加結(jié)束后的ATP合成酶活性均明顯提高，其中pH 3.5更有利于將ATP合成酶活性提高到較高水平。因此，在NADH供給充足的前提下，細(xì)胞在pH 3.5條件下可以合成更多ATP，以滿足生長和代謝的需要。

圖3 不同pH值條件下的HK和IDH活性Fig. 3 Activities of HK and IDH under different pH conditions

圖4 不同pH值條件下的ATP合成酶活性Fig. 4 Activity of ATP synthase under different pH conditions

2.4 胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)水平及比率

圖5 不同pH值條件下的胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)含量及比率Fig. 5 Intracellular levels and ratios of energy metabolism substances under different pH conditions

為了考察pH值對酵母能量代謝的影響，對胞內(nèi)與能量代謝有關(guān)的輔因子物質(zhì)（NADH、NAD+、ATP和ADP）含量進(jìn)行測定。圖5結(jié)果表明，不同pH值條件下的胞內(nèi)NADH和ATP含量均在第30小時達(dá)到最高水平，且pH 3.5比pH 2.5和pH 5.0的水平更高。與此同時，NADH/NAD+和ATP/ADP比率在30 h后均處于較為穩(wěn)定的水平，其中pH 3.5時的比率更高，體現(xiàn)出弱酸脅迫環(huán)境下NADH和ATP具有更強(qiáng)的再生能力，為胞內(nèi)能量物質(zhì)的充足供給提供有力保障。

2.5 胞內(nèi)氧化還原環(huán)境

圖6 不同pH值條件下的CAT和SOD活性Fig. 6 Activities of CAT and SOD under different pH conditions

圖7 不同pH值條件下的胞內(nèi)MDA含量Fig. 7 Intracellular contents of MDA under different pH conditions

為考察pH值對酵母胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的影響，測定CAT、SOD活性以及MDA含量，結(jié)果見圖6、7?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 2.5時的不同培養(yǎng)時間下CAT、SOD活性和MDA含量與對照（pH 5.0）相比沒有顯著差異；而pH 3.5時的CAT活性明顯高于對照，SOD活性變化不大，而胞內(nèi)MDA含量則相應(yīng)下降。以上結(jié)果表明，弱酸脅迫有利于CAT活性的提高，同時也有助于保護(hù)細(xì)胞和細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激損傷。

3 討 論

酸脅迫常見于食品發(fā)酵工業(yè)中。一般認(rèn)為，環(huán)境中較低的pH值將促使H+通過細(xì)胞膜滲漏進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致微生物胞內(nèi)pH值下降，進(jìn)而影響胞內(nèi)的一系列生化以應(yīng)和細(xì)胞的正常生長與代謝[17,24]。為適應(yīng)酸脅迫環(huán)境，維持胞內(nèi)pH值的相對穩(wěn)定，微生物細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出多種調(diào)節(jié)機(jī)制，主要包括：消耗ATP將H+泵出胞外[25]、通過激活特定酶系消耗胞內(nèi)的H+[26]、誘導(dǎo)細(xì)胞合成伴侶蛋白以修復(fù)損傷[27]、改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以保護(hù)細(xì)胞免受傷害[28]等。此外，有研究結(jié)果表明，GSH在微生物抵抗酸脅迫過程中也具有積極作用，GSH可以通過作為“自殺式”消耗的底物阻止胞內(nèi)pH值的快速下降[29-30]。本研究利用GSH的這種生理特性，通過對產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行弱酸脅迫處理，實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)條件下的GSH過量合成，酵母細(xì)胞的SAM合成能力也有明顯提高。在此基礎(chǔ)上，對弱酸脅迫在SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)中的作用及其生理機(jī)制進(jìn)行了解析。

在酵母細(xì)胞內(nèi)，SAM和GSH均屬于甲硫氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點物質(zhì)[31]。在甲硫氨酸供給充足的前提下，關(guān)鍵酶MAT和γ-GCS活性的提高將有利于SAM和GSH的過量合成。本研究結(jié)果表明，強(qiáng)酸脅迫條件下的MAT和γ-GCS活性均受到部分抑制，而弱酸脅迫則有助于將關(guān)鍵酶活性維持在更高的水平。因此，弱酸脅迫提高了產(chǎn)朊假絲酵母合成SAM和GSH的能力，從而進(jìn)一步提升了高密度培養(yǎng)下SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量。

除物質(zhì)代謝以外，能量代謝物質(zhì)ATP的供給與消耗也是決定SAM和GSH能否過量合成的重要因素[13]。產(chǎn)朊假絲酵母利用葡萄糖進(jìn)行好氧生長和代謝時，中心代謝途徑中HK和IDH以及ATP合成酶的活性將影響到葡萄糖的消耗、NADH和ATP的形成[9]。通過對不同pH值條件下HK和IDH活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫雖然對IDH活性影響不大，但提高了HK活性，加速了葡萄糖的利用，有利于NADH的形成。同時，ATP合成酶活性在弱酸脅迫條件下也有明顯的提高，從而加快了從NADH到ATP代謝的進(jìn)程。結(jié)合胞內(nèi)NADH和ATP水平、NADH/NAD+和ATP/ADP比率結(jié)果可以得出，弱酸脅迫促進(jìn)了能量代謝物質(zhì)的合成和再生，為SAM和GSH過量合成所需ATP提供了充足的保障。

微生物細(xì)胞在遭遇脅迫環(huán)境時，容易產(chǎn)生自由基而影響到胞內(nèi)氧化還原環(huán)境[32-33]。胞內(nèi)消除自由基損傷的機(jī)制主要包括具有抗氧化能力的酶類和還原性物質(zhì)[34]。本研究的CAT和SOD活性結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母抵抗弱酸脅迫可能主要依賴于CAT活性的提高，而在強(qiáng)酸脅迫條件下的抵抗機(jī)制應(yīng)該更多地來自于還原性物質(zhì)的保護(hù)。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)與自由基發(fā)生過氧化以應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的高低通常體現(xiàn)出細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化程度和細(xì)胞損傷程度[35]。本研究弱酸脅迫下的MDA含量低于強(qiáng)酸脅迫和pH 5.0時的結(jié)果，表明該條件下的胞內(nèi)氧化還原環(huán)境更加有利于細(xì)胞維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，這一方面得益于胞內(nèi)更高的CAT活性，另一方面也要歸功于胞內(nèi)更高的GSH含量。

綜上，本實驗考察并比較了不同pH值條件下的產(chǎn)朊假絲酵母高密度培養(yǎng)過程，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫有利于提升SAM和GSH的合成能力，進(jìn)而提高了SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量。在分析發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合SAM和GSH生物合成關(guān)鍵酶活性、能量代謝物質(zhì)的水平與比率，以及胞內(nèi)氧化還原水平，部分解析了弱酸脅迫促進(jìn)SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)的生理機(jī)制。研究結(jié)果有助于深入理解酵母細(xì)胞響應(yīng)酸脅迫的生理機(jī)制，同時也為提高SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量提供了一種可行的思路。