基于特征圖譜分析百合飲片、湯劑、中間體、顆粒相關(guān)性

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

藥用百合，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為百合科植物卷丹、百合或細(xì)葉百合的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]。江蘇宜興、湖南邵陽、甘肅蘭州和浙江湖州栽培百合歷史悠久，為全國(guó)“四大百合產(chǎn)區(qū)”[2]。百合配方顆粒由百合飲片在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，利用現(xiàn)代制藥技術(shù)，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒和包裝等精制而成，其功能、主治、性味、歸經(jīng)與傳統(tǒng)百合飲片一致。由于配方顆粒缺少了傳統(tǒng)飲片賴以判別優(yōu)劣的外形、氣味等性狀特征，為保證其顆粒的質(zhì)量，規(guī)定通過特征圖譜的方式進(jìn)行不同環(huán)節(jié)之間的鑒別。李敏等[3]對(duì)中藥白芍親緣性進(jìn)行分析并對(duì)分子進(jìn)行鑒定標(biāo)記，為其他中藥材品種的分子水平的鑒定研究提供了參考。以藥材(飲片)、水煎劑、配方顆粒的相關(guān)性為基礎(chǔ)的特征圖譜研究可以準(zhǔn)確地表達(dá)其特征的追溯性[4]。周永妍等[5]對(duì)獨(dú)腳金配方顆粒、水煎劑、飲片特征圖譜進(jìn)行了比較研究，為全面控制獨(dú)腳金配方顆粒的質(zhì)量提供了方法；陳潔等[6]利用HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地頭頂一顆珠進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)；孫福仁等[7]基于UPLC特征圖譜與主成分分析對(duì)白芷配方顆粒進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)。郭秋平[8]對(duì)不同來源藥用百合及其總皂苷建立相關(guān)HPLC指紋圖譜，并綜合建立3 種不同來源藥用百合共同的特征圖譜，經(jīng)相似度比較，得出藥用百合總皂苷來源均一，質(zhì)量穩(wěn)定。蔡寶昌等[9]構(gòu)建百合藥材低極性部位的GC/MS指紋圖譜，比較不同產(chǎn)地、不同品種百合中脂溶性成分的整體相似性，結(jié)果顯示藥用百合的整體相似度較食用百合高，且同一產(chǎn)區(qū)的樣品相似度較高。聚類分析指將物理或抽象對(duì)象的集合分組為由類似的對(duì)象組成的多個(gè)類的分析過程。王萬良等[10]研究的聚類算法基于ADAM拉普拉斯約束，有更高的聚類效果和更快的運(yùn)行效率，綜合性能優(yōu)于相關(guān)的聚類方法。陸億紅等[11]研究的基于區(qū)間數(shù)的不確定數(shù)據(jù)流的聚類算法，具有良好的聚類效果，提高了不確定數(shù)據(jù)流聚類的聚類質(zhì)量和速率。

本研究采用HPLC法建立了百合配方顆粒的特征圖譜，并考察標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片、中間體、配方顆粒之間的相關(guān)性，旨在用于百合配方顆粒生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，也可為中藥配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供參照。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 科技有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 科技有限公司)，電子天平(YP502N，上海菁海儀器有限公司)，萬分之一電子天平(BS124，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，電子煎藥壺(FT-30系列，深圳市正云科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R210+V700，瑞士Buchi公司)，德國(guó)eppendor小型離心機(jī)(Centrifuge mini)，PD-1D-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-D，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE，鞏義市予華儀器有限公司)，干法制粒機(jī)(GZL100-25L，石家莊科源機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

10 批百合飲片(表1)，10 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑(自制)，10 批噴干粉(自制)，10 批配方顆粒(自制)。乙腈(色譜純，TEDIA)，甲酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，純水(杭州娃哈哈有限公司)。

表1 10 批百合飲片產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 10 batches of Lily slices

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 百合飲片供試品溶液的制備

取百合飲片粉末約1 g，加純水50 mL，加熱回流45 min(沸騰后計(jì)時(shí))，取適量藥液離心，13 000 r/min離心5 min，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

采用電子煎藥壺煎煮，取百合飲片100 g，加8倍水浸泡30 min，加熱沸騰后先武火煎煮30 min，后改文火煎煮30 min，趁熱過120 目篩網(wǎng)，藥渣再加6倍水，加熱沸騰后武火煎煮30 min，趁熱過濾，合并兩次藥液，得400～600 mL，即百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.3 百合配方顆粒的制備

按2.2項(xiàng)下制得的百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑減壓濃縮，60～65 ℃，真空度-0.08 MPa，濃縮到相對(duì)密度(相對(duì)于純水)為1.05～1.08 (25 ℃)，以浸膏不粘壁，流動(dòng)性好為宜，得清膏。清膏噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度180～185 ℃，出風(fēng)溫度85～90 ℃，得浸膏粉(即中間體)。浸膏粉加適量輔料干法制粒。

2.4 色譜條件

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫按表2進(jìn)行，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

表2 梯度表Table 2 Gradient table

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察

取百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取同一份供試品溶液20 μL，依照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：筆者方法共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均不大于0.06%，相對(duì)峰面積RSD均不大于0.75%，精密度良好。

表3 精密度考察結(jié)果(峰面積)Table 3 Precision test results (peak area)

2.5.2 重復(fù)性考察

取百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，依照上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表4。結(jié)果表明：筆者方法共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均不大于0.09%，相對(duì)峰面積RSD除3號(hào)峰為7.13%外，均不大于1.32%，重現(xiàn)性良好。

表4 重復(fù)性考察結(jié)果(峰面積)Table 4 Repeated results (peak area)

2.5.3 穩(wěn)定性考察

取百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，結(jié)果見表5。結(jié)果表明：筆者方法共有峰的相對(duì)峰面積RSD均不大于3.71%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果(峰面積)Table 5 Stability results (peak area)

2.6 百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、顆粒的特征圖譜

按照2.4項(xiàng)下的色譜條件，分別得到10 批百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、顆粒的特征圖譜，如圖1所示。

圖1 百合不同階段的特征圖譜Fig.1 Characteristic maps of Lily at different stages

2.7 色譜條件選擇

205，230，280，320，268 nm等多波長(zhǎng)測(cè)試結(jié)果顯示280 nm下峰的信息量較多，峰型及分離度較好，因此選擇280 nm作為百合指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。分別考察了0.8，1.0，1.2 mL/min 3 個(gè)流速對(duì)出峰時(shí)間和峰面積的影響，結(jié)果顯示：流速對(duì)特征峰的出峰時(shí)間和峰面積有影響，流速1.2 mL/min時(shí)各特征峰峰面積均較小，流速1.0 mL/min較流速0.8 mL/min特征峰出峰時(shí)間快，故選擇流速為1.0 mL/min。同時(shí)也考察不同儀器的耐用性，安捷倫1290 UHPLC、安捷倫1260 HPLC、安捷倫1290 UHPLC、安捷倫1260 HPLC在45 min內(nèi)均能完成各特征峰的分析，但安捷倫1290 UHPLC色譜圖中4號(hào)峰、5號(hào)峰峰面積較高，故選擇安捷倫1290 UHPLC進(jìn)行百合標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜分析較合適。

2.8 數(shù)據(jù)處理

2.8.1 10 批百合飲片的主成分分析

以5 個(gè)特征峰面積為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 12.0為統(tǒng)計(jì)工具，進(jìn)行主成分分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的累積方差貢獻(xiàn)率可達(dá)98.02%，至第3主成分(PC3)的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.57%，說明前3 個(gè)主成分基本包含了5 個(gè)峰變量的全部信息。其中，前兩個(gè)主成分得分最高的是峰1、峰2、峰4，說明這3 個(gè)峰對(duì)藥材質(zhì)量的影響最大。對(duì)PC1和PC2的得分向量作圖，結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)10批藥材都在一組，說明本研究中所用到的各個(gè)產(chǎn)地的百合藥材在主要化學(xué)成分上無較大區(qū)別，質(zhì)量均一。

圖2 百合飲片特征圖譜主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of the characteristic map of Lily pieces

2.8.2 特征圖譜的相關(guān)性分析

采集百合飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體及配方顆粒的特征圖譜進(jìn)行疊加比較分析，可觀察從原料到成品的化學(xué)成分變化，同時(shí)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版”進(jìn)行相似度計(jì)算，以標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有模式為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后進(jìn)行Mark峰匹配。飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體及配方顆粒的特征圖譜的疊加效果如圖3所示，可知百合飲片的5 個(gè)特征共有峰在標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、顆粒的色譜圖中均可找到對(duì)應(yīng)峰，說明配方顆粒的主要化學(xué)成分可追溯。

圖3 特征圖譜疊加圖Fig.3 Characteristic atlas overlay map

3 結(jié) 論

筆者采用特征圖譜技術(shù)結(jié)合主成分分析，對(duì)10 批不同產(chǎn)地的百合飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。配方顆粒沒有傳統(tǒng)飲片賴以判別優(yōu)劣的外形、氣味等性狀特征，無法通過傳統(tǒng)方法判別優(yōu)劣，本研究可以一定程度上確保其與傳統(tǒng)飲片水煎劑的一致性。同時(shí)，筆者建立的特征圖譜方法適用于百合配方顆粒的整個(gè)生產(chǎn)流程，為百合配方顆粒的質(zhì)量控制提供了參考。研究表明：所擬定的百合配方顆粒特征圖譜與百合飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似性高、化學(xué)成分基本一致，說明藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒之間的化學(xué)成分可追溯，可用于百合配方顆粒的質(zhì)量控制，也可用于生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。