甜茶顆粒劑對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

劉英1，徐永莉，馮世鑫，閆志剛

(1. 廣西城市職業(yè)大學(xué)，廣西 崇左 530000；2. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023)

甜茶是一種在中國(guó)西南地區(qū)廣泛種植薔薇科灌木，其具有天然的甜味，故其葉子通常用作涼茶。隨著人們生活水平的提高，因高脂、高糖飲食而引發(fā)的慢性疾病在人群中的比例也隨之上升。甜茶作為一種傳統(tǒng)民間茶飲植物，由于其在降低三高、抗氧化、抗血管生成、增強(qiáng)免疫力和抗過(guò)敏等方面的藥理作用而備受專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。

目前甜茶的研究?jī)?nèi)容主要分布在藥理毒理、化學(xué)成分、生物學(xué)、組織培養(yǎng)、栽培繁殖技術(shù)以及應(yīng)用研究等方面，其中甜茶的應(yīng)用研究與藥理毒理研究比較廣泛，集中體現(xiàn)在甜茶的降血糖、降血脂、抗氧化和抗過(guò)敏作用的研究，但對(duì)甜茶保肝、護(hù)肝方面的作用研究較少。甜茶保肝護(hù)肝藥理作用研究較多，但未見有甜茶顆粒劑對(duì)肝損傷保護(hù)方面的研究報(bào)道。本研究以自制甜茶顆粒劑為原料，探究其對(duì)四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)別雄性昆明小鼠，體重(18.00±2.00) g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心單位使用許可證號(hào)為：SYXK桂2014-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)耗材 甜茶顆粒劑(自制)；CCl4，AR(成都市科龍化工試劑廠)；聯(lián)苯雙酯滴丸(廣西星群藥業(yè)股份有限公司)；甲醛，AR(成都市科龍化工試劑廠)；無(wú)水乙醇，AR(成都市科龍化工試劑廠)；BCA法蛋白定量測(cè)試盒，批號(hào)：20190215(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)測(cè)試盒，批號(hào)：20190124(南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號(hào)：20190128(南京建成生物工程研究所)；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；TDL-5臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；全自動(dòng)血生化儀，型號(hào)：7100(株式會(huì)社日立制作所)。

1.3 甜茶顆粒劑急性毒性試驗(yàn) 量取5 ml蒸餾水放入燒杯中，最大限量地溶解甜茶顆粒劑，能夠溶解12 g甜茶顆粒劑，溶解后的顆粒劑為粘稠狀，灌胃針能夠抽吸出來(lái)。清潔級(jí)雄性昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為3組：空白組、24克顆粒劑/千克、48克顆粒劑/千克。以最大口服劑量(0.2 ml/10 g)灌胃小鼠，觀察兩個(gè)給藥組與空白組小鼠的情況，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩個(gè)給藥組的小鼠與正常組小鼠相比較，給藥組小鼠灌胃給藥5 min后的活動(dòng)較為緩慢，12 h后活動(dòng)能力恢復(fù)正常，呼吸正常，大小便正常，正常飼養(yǎng)兩周未見小鼠死亡，表明小鼠最大耐受量大于48克顆粒劑/千克。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠分組及急性肝損傷模型制備 SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，體重(18.00±2.00) g，自然通風(fēng)的環(huán)境下，讓小鼠自由飲水及普通飲食[1-4]，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為6組，每組10只：空白對(duì)照(生理鹽水)組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥(150 mg/kg)組、甜茶顆粒劑低劑量(3.375克生藥/千克)組、甜茶顆粒劑中劑量(6.75克生藥/千克)組、甜茶顆粒劑高劑量(13.50克生藥/千克)組。每組小鼠用苦味酸做好相應(yīng)的編號(hào)標(biāo)記，稱量小鼠體重并做好相關(guān)實(shí)驗(yàn)記錄?？瞻讓?duì)照組和CCl4組分別按照0.1 ml/10 g生理鹽水灌胃，藥物組分別按照0.1ml/10 g藥物灌胃，每天1次，連續(xù)給藥7 d。最后一次給藥后1 h，開始對(duì)小鼠進(jìn)行造模，空白對(duì)照組注射等量的生理鹽水，模型組和其他各劑量組按照給藥容量0.1 ml/10 g腹腔注射0.125% CCl4花生油溶液。造模完成后，對(duì)小鼠禁食不禁水，22 h后，摘取小鼠眼球進(jìn)行取血并取其肝臟、脾、胸腺進(jìn)行稱量，分裝，試驗(yàn)測(cè)定[5-9]。

1.4.2 樣本采集 用鑷子快速摘取小鼠眼球，取血裝于1.5 ml EP管中，取完血后，離心機(jī)4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，使血清分離。用移液槍量取出上層血清，裝入EP管中并放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆??？焖俳馄嗜⊙蟮男∈螅∑涓闻K、脾臟和胸腺等器官，用生理鹽水清洗并用濾紙吸干表面水分和殘血，稱量記錄其重量。在肝右葉相同部位取黃豆大小組織，放入10%甲醛溶液中固定，保存待用于組織病理觀察試驗(yàn)。

1.4.3 臟器指數(shù) 取材之前稱量記錄各組小鼠的體重及取材后相應(yīng)的肝、脾和胸腺的重量，所得相應(yīng)的臟器重量在小鼠體重的占比即為臟器指數(shù)，各臟器指數(shù)按照以下公式計(jì)算：

小鼠肝臟指數(shù)(%)=[肝重(g)/體重(g)]×100%

小鼠脾臟指數(shù)(%)=脾重(mg)/體重(g)×100%

小鼠胸腺指數(shù)(%)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%

1.4.4 檢驗(yàn)小鼠血清AST和ALT活性 小鼠眼球采血分離取血清后，上層血清放入-80℃冰箱保存待測(cè)。利用廣西醫(yī)科大學(xué)全自動(dòng)血生化儀對(duì)小鼠血清中的AST與ALT活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 檢驗(yàn)小鼠肝組織中SOD和MDA活性 準(zhǔn)備待測(cè)備用的肝臟組織，勻漿，離心，按照SOD試劑盒和MDA試劑盒說(shuō)明書操作規(guī)程步驟來(lái)檢驗(yàn)SOD活性和MDA活性，其中肝臟中的蛋白含量濃度用BCA法檢驗(yàn)。

1.4.6 HE染色檢驗(yàn)小鼠肝臟病理變化 在肝臟相同部位取黃豆大小組織塊，置于10%甲醛溶液固定24 h，脫水，浸蠟包埋，切片烤片，HE染色觀察肝組織受損情況。

2 結(jié)果

2.1 甜茶顆粒劑對(duì)小鼠CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷臟器指數(shù)的影響 藥物CCl4導(dǎo)致小鼠急性肝損傷后，小鼠肝組織腫脹，表面不平滑，具有白色小顆粒。從臟器指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，CCl4模型組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)都高于正常組的臟器指數(shù)，其中肝臟指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，脾和胸腺指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組、甜茶顆粒低劑量組和甜茶顆粒中劑量組的肝臟系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而甜茶顆粒高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 甜茶顆粒劑對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷臟器指數(shù)影響

2.2 甜茶顆粒劑對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠ALT、AST活力的影響 模型組小鼠的肝功能生化指標(biāo)ALT與AST活力遠(yuǎn)超過(guò)正?？瞻捉M小鼠活力，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥組與模型組相比較，其中ALT活性的P<0.05，AST活性比較P<0.01，其差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甜茶顆粒劑低、中、高劑量組分別與模型組相比較，甜茶顆粒低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2甜茶顆粒劑對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠ALT、AST活力的影響單位：U·L-1

組別nALTAST正常空白組1048.00±5.48137.75±14.49CCl4模型組101742.25±429.10a686.00±439.35a聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥組(150 mg/kg)101362.75±363.47b322.00±237.20c甜茶顆粒 低劑量組(3.375克生藥/千克)101452.75±403.83511.13±266.01 中劑量組(6.75克生藥/千克)101278.50±581.42b334.50±206.11b 高劑量組(13.50克生藥/千克)101066.13±337.57c260.50±98.94c

2.3 甜茶顆粒劑對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠SOD、MDA活性的影響 小鼠肝組織受損傷后，其SOD活性有所下降，模型組小鼠肝組織SOD活性較正常組小鼠肝組織低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥組與模型組的SOD活性比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甜茶顆粒中劑量組與甜茶顆粒高劑量組分別與CCl4模型組比較SOD活性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。從小鼠肝組織MDA活性比較，模型組小鼠肝組織MDA活性較高，甜茶顆粒劑高劑量組較模型組MDA活性低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠SOD與MDA活性結(jié)果見表3。

表3 甜茶顆粒劑對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠SOD、MDA活性的影響

2.4 HE染色病理切片結(jié)果 正?？瞻捉M小鼠的肝組織中肝細(xì)胞排列沿中央靜脈呈現(xiàn)出放射索狀，整個(gè)肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰完整；CCl4模型組小鼠的肝組織中肝細(xì)胞排列較紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)較為模糊，具有充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)癥狀，肝損傷癥狀較為明顯；聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥組相比模型組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰整齊，只有微量炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)；甜茶顆粒劑低劑量組、甜茶顆粒劑中劑量組、甜茶顆粒劑高劑量組的小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與模型組相比，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸清晰完整，炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)癥狀不明顯，損傷程度逐漸減輕，病理組織切片見圖1。

注：圖A.正?？瞻捉M；圖B. CCl4模型組；圖C.聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥組；圖D.甜茶顆粒劑低劑量組(3.375克生藥/千克)；圖E. 甜茶顆粒劑中劑量組(6.75克生藥/千克)；圖F.甜茶顆粒劑高劑量組(13.50克生藥/千克)

3 討論

肝臟是人體系統(tǒng)中的重要五臟器官之一，是人體健康成分中不可缺少的部分。肝炎的機(jī)制和原因主要涉及到的環(huán)節(jié)為自由基損傷、病毒制作以及炎癥性介質(zhì)因子的釋放等[10]。肝損傷類型主要有酒精性、化學(xué)性、藥物性和免疫性損傷，臨床表現(xiàn)主要有肝損傷壞死、變性、肝纖維化、肝組織硬化、肝臟癌癥等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立化學(xué)試劑CCl4誘導(dǎo)小鼠化學(xué)性急性肝損傷模型，目前保肝護(hù)肝藥物藥理作用及機(jī)制研究普遍用此法造模。小鼠CCl4造模實(shí)驗(yàn)方法較為成熟，造模成功率較高，具有較高的可行性和可操作性。CCl4造模機(jī)制是化合物進(jìn)入體內(nèi)從而氧化肝微粒體細(xì)胞色系P450后，生成三氯甲烷自由基和氯自由基，使肝微粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化，致使自由基增加，SOD活性降低和MDA升高，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，肝細(xì)胞內(nèi)ALT和AST 逸出，進(jìn)入血液，含量升高[11-12]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給藥7 d后造模，造模后檢測(cè)各給藥組與空白組、陽(yáng)性藥組生化指標(biāo)及病理切片，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各給藥組與空白組、陽(yáng)性藥組之間的意義，探究甜茶顆粒劑對(duì)小鼠肝臟的預(yù)防保護(hù)作用。

造模后小鼠的生化指標(biāo)ALT活性大于正常組的兩倍，表明小鼠急性肝損傷[13-15]造模成功。以此模型探討自制的甜茶顆粒劑對(duì)小鼠的保肝護(hù)肝的作用效果，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的生化指標(biāo)與病理組織學(xué)測(cè)定，甜茶顆粒劑低、中、高劑量組均能降低小鼠生化指標(biāo)ALT和AST的活性，其中劑量組(6.75克生藥/千克)、高劑量組(13.50克生藥/千克)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甜茶中劑量組與甜茶顆粒劑高劑量組的小鼠病理組織形態(tài)中肝細(xì)胞和肝小葉具有較為完整清晰的結(jié)構(gòu)，表明甜茶顆粒劑中劑量組與甜茶顆粒劑高劑量組保肝護(hù)肝的藥理作用顯著。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甜茶顆粒劑對(duì)小鼠的急性肝損傷具有保護(hù)作用，至于其如何發(fā)揮保肝護(hù)肝作用尚未明確，其作用機(jī)制有待下一步深入研究。