孤兒核受體Nur77基因多態(tài)性與膿毒癥易感性的關(guān)聯(lián)研究

堯國勝黃高吳曉文農(nóng)榮卯黃非凡黃寶雍陸政唐寧廖品琥

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2. 百色市人民醫(yī)院，廣西 百色 533000；3. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530000；4. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，廣西 武鳴 530100；5. 右江民族醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

膿毒癥是指宿主對感染產(chǎn)生失控性炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙的一組綜合征，其發(fā)病率與死亡率均居高不下，且發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。Nur77是核受體(Nuclear Receptor，NR)超家族成員之一，作為轉(zhuǎn)錄因子，是一類早期即刻反應(yīng)基因，細(xì)胞在感受到環(huán)境的生理與病理刺激時(shí)，該基因?qū)⒀杆俜磻?yīng)，合成相應(yīng)的蛋白以應(yīng)對這些刺激。既往研究表明Nur77通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因6(Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor 6，TRAF6)、核因子-κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)等相互作用，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮雙向調(diào)控作用[2]。膿毒癥是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的多基因性疾病，基因多態(tài)性，尤其是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是決定個(gè)體膿毒癥易感性、表型、治療反應(yīng)和臨床轉(zhuǎn)歸的重要因素[3]?，F(xiàn)國內(nèi)外有報(bào)道Nur77基因多態(tài)性與糖尿病腎病[4]、運(yùn)動(dòng)障礙[5]等疾病相關(guān)，但是，對于Nur77基因多態(tài)性與膿毒癥的關(guān)系尚缺乏研究。本文擬通過研究廣西人群中Nur77基因相關(guān)位點(diǎn)的等位基因及其基因型的分布情況，進(jìn)一步探討Nur77基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥易感性的關(guān)聯(lián)，以期闡明Nur77基因多態(tài)性在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 選取2018年6月—2019年7月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、百色市人民醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院的重癥醫(yī)學(xué)科收治的膿毒癥患者共207例作為膿毒癥組，男性150例，女性57例，平均年齡(58.03±13.34)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①18歲≤年齡≤80歲；②相互間無生物學(xué)親緣關(guān)系；③符合膿毒癥和膿毒性休克第三版國際共識定義[1]診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲或>80歲；②心臟停搏者; ③非感染因素所導(dǎo)致的炎性病變，如出血性休克、免疫介導(dǎo)的器官損傷等；④長期或近期接受過免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療；⑤其他特殊病例，如腫瘤、人類獲得性免疫缺陷病毒感染、自身免疫功能紊亂的病例；⑥近期接受化療或放療的病人。隨機(jī)選取本院同期無親緣關(guān)系的健康體檢者210例作為對照組，其中男性158例，女性52例，平均年齡(56.17±12.38)歲。兩組年齡和性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，征得患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 用EDTA-K2抗凝采血管采集入住ICU 24h內(nèi)的膿毒癥患者外周靜脈血3ml，對照組受試者采集清晨空腹外周靜脈血。使用天根生化[(北京)科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP348-03)]并采用離心柱法嚴(yán)格按說明操作提取全基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，引物用在線Primer3設(shè)計(jì)(見表1)，由上海生工公司合成，擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(20 μl)包含1× GC-I buffer(Takara)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP，1 μmol/L HotStarTaq polymerase (Qiagen) 、1 μl樣本DNA和1 μl多重PCR引物。擴(kuò)增參數(shù)：第一步，95℃預(yù)變性2 min；第二步，94℃變性20 s，65℃退火40 s，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸1.5 min，共11個(gè)循環(huán)；第三步，94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共24個(gè)循環(huán)；第四步，72℃延伸2 min，產(chǎn)物保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 Nur77基因位點(diǎn)PCR引物序列

注：SNP：Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性；PCR：polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應(yīng)

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化 在10 μl PCR產(chǎn)物中加入5 U蝦堿酶(Promega，貨號：M9910)和2 U外切酶I(Epicentre，貨號：UEM04100)，37℃溫浴1 h后75℃滅活15 min。

1.2.4 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng) 采用SNaPshot Multiplex kit(ABI，貨號：4323159)進(jìn)行延伸反應(yīng)。10 μl延伸反應(yīng)體系中包含5 μlSNaPshot Multiplex Ready Mix，2 μl純化后PCR產(chǎn)物，2 μl超純水及1 μl延伸引物混合物。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?6℃預(yù)變性1 min；第二步，96℃變性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 延伸反應(yīng)產(chǎn)物純化 將1 U 蝦堿酶加入10 μl延伸產(chǎn)物中，37℃溫浴1 h，而后75℃滅活15 min。

1.2.6 測序及數(shù)據(jù)分析 將0.5 μl 純化延伸產(chǎn)物與9 μl Hi-Di 及0.5 μl Liz120 SIZE STANDARD混勻，于95 ℃變性5 min，在ABI 3730xl測序儀上樣檢測。所得數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4.1(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥組患者臨床特征 本研究納入的膿毒癥患者中，胸腹部為主要感染部位(85.00%)，其次為泌尿系、膽道、四肢及顱腦，聯(lián)合感染者8例。病情發(fā)展至膿毒性休克者85 例，見表2。

表2 膿毒癥患者臨床特征

注：①△：多部位感染8例；②表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示

2.2 Nur77基因多態(tài)性與膿毒癥易感性的關(guān)聯(lián)分析 所選4個(gè)SNPs在對照組及病例組均滿足Hardy-Weinberg平衡定律，提示研究樣本具有群體代表性。校正了年齡、性別等混雜因素后，膿毒癥組和對照組之間rs10876228、rs11169989、rs1283155、rs2242107各基因型頻率在各種遺傳模型下差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Nur77基因多態(tài)性與膿毒癥易感性的關(guān)聯(lián)分析

注：①所有OR值均經(jīng)性別及年齡等因素的校正；②表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示；③NA：No Available，因病例組C/C基因型病例數(shù)為0，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

續(xù)表3 Nur77基因多態(tài)性與膿毒癥易感性的關(guān)聯(lián)分析

注：①所有OR值均經(jīng)性別及年齡等因素的校正；②表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示；③NA：No Available，因病例組C/C基因型病例數(shù)為0，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 討論

膿毒癥是宿主對感染的失控反應(yīng)，可導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]，是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一，給全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大負(fù)擔(dān)[4]。盡管膿毒癥指南不斷更新，其發(fā)病率仍有持續(xù)增長的趨勢，住院病死率依然居高不下，成為ICU非心臟重癥患者最常見的死亡原因之一。Vincent JL等[6]一項(xiàng)基于全球膿毒癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)的研究結(jié)果顯示，ICU中膿毒癥發(fā)病率高達(dá)29.5%，病死率達(dá)25.8%。嚴(yán)重膿毒癥(含膿毒性休克)在國內(nèi)ICU 的發(fā)病率為37.3%，ICU 病死率及住院病死率分別為28.7%和33.5%[7]。

膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及機(jī)體多個(gè)器官功能改變，對其發(fā)病本質(zhì)的探索一直是全球的研究熱點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者分別從炎癥反應(yīng)失衡[8]、免疫功能障礙[9]、凝血異常[10]、免疫網(wǎng)絡(luò)[11]、線粒體損傷[10]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]、細(xì)胞自噬[12]、基因多態(tài)性[3]等方面對膿毒癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得一定的進(jìn)展?；蚨鄳B(tài)性是指基因序列上的變異，其決定了人體對應(yīng)激刺激的易感性和耐受性、臨床表現(xiàn)的多樣性、對藥物治療效果的差異性。目前，關(guān)于膿毒癥基因多態(tài)性的研究涉及了腫瘤壞死因子家族、白細(xì)胞介素家族、熱休克蛋白70、CD14、纖溶酶原激活因子抑制劑等[13]。探索膿毒癥與基因多態(tài)性的關(guān)系將有助于從基因水平揭示膿毒癥的發(fā)病機(jī)制。

核受體(NR)是一類依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子超家族，由于配體激活機(jī)制，核受體成為了機(jī)體環(huán)境與基因組之間的連接。核受體4亞家族A群(Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A，NR4A)是一類早期即刻反應(yīng)基因，細(xì)胞在感受到環(huán)境的生理與物理刺激時(shí)，該家族的基因就會迅速反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達(dá)從而來應(yīng)對這些刺激[14]。Nur77是NR4A家族中的一員，定位于12q13染色體上[15]，Nur77由數(shù)個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，包括N末端激活功能1結(jié)構(gòu)域，具有兩個(gè)允許DNA相互作用的鋅指的中心DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端配體結(jié)合域，其中C末端配體結(jié)合域?qū)τ谀技∮H脂性分子(配體)在這些受體的轉(zhuǎn)錄活性中起分子開關(guān)的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)NR4A家族在多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及物質(zhì)代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用。Nur77可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的活性在多種疾病炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Nur77在炎性疾病，如：滑膜炎、結(jié)腸癌、銀屑病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、多發(fā)性硬化都有異常表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)顯示Nur77可被多種促炎性因子誘導(dǎo)快速表達(dá)，如脂多糖、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、白細(xì)胞介素、氧化型低密度脂蛋白等[17]。巨噬細(xì)胞中，Nur77可在多種刺激作用下快速表達(dá)，其誘導(dǎo)機(jī)制主要是NF-κB依賴性的轉(zhuǎn)錄激活作用。NF-κB可以與Nur77啟動(dòng)子中的反應(yīng)元件結(jié)合從而激活Nur77，進(jìn)而激活多種炎癥基因的表達(dá)，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。以往的研究表明，Nur77在炎癥反應(yīng)中可能具有雙向的調(diào)控作用，即，Nur77既可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，亦可抑制炎癥發(fā)生。然而，由于這些研究僅僅局限于體外的細(xì)胞水平，仍無法證實(shí)Nur77在體內(nèi)炎癥調(diào)控中的作用及功能。最近的研究強(qiáng)調(diào)了Nur77作為炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑的作用。Nur77被炎癥刺激迅速誘導(dǎo)，以非配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子形式調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥免疫功能，表明它們是引發(fā)炎癥所必需的。然而，Nur77抗炎特性表明這種急性調(diào)節(jié)可能是一種旨在解決后期炎癥的保護(hù)性反應(yīng)。Wu H等[2]發(fā)現(xiàn)Nur77通過與TRAF6相互作用充當(dāng)Toll樣受體/白介素-1受體信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)物，這種相互作用阻止了TRAF6的自身泛素化和寡聚化，并隨后抑制NF-κB活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此表明，Nur77參與負(fù)反饋機(jī)制以維持炎癥平衡[19]。Li XM等[20]發(fā)現(xiàn)敲除Nur77的小鼠可發(fā)生較嚴(yán)重的全身性免疫及炎癥性疾病，且炎癥因子白介素6的表達(dá)顯著提高，而Nur77在克羅恩病以及潰瘍性結(jié)腸炎患者病變組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，說明孤兒核受體Nur77可作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展[2]。

綜上，Nur77基因的rs10876228、rs11169989、rs1283155、rs2242107四個(gè)位點(diǎn)都存在三種基因型，這三種基因型分布頻率在膿毒癥組與健康對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這四個(gè)Nur77基因位點(diǎn)多態(tài)性與膿毒癥易感性可能無相關(guān)性。