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    基于表面等離子共振技術的抗體濃度檢測方法建立及驗證*

    2020-05-30 01:22:12王永智葉華躍聶利芳雷高新李磊彭福中喬正
    醫(yī)藥導報 2020年5期
    關鍵詞:單克隆緩沖液回收率

    王永智,葉華躍,聶利芳,雷高新,李磊,彭福中,喬正

    (1.泰州醫(yī)藥高新技術產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心,泰州 225300;2.江蘇大同盟制藥有限公司,泰州 225300)

    單克隆抗體藥物因其具有特異性強、療效好、副作用少等優(yōu)點逐步成為腫瘤、自身免疫疾病、心血管等疾病的理想治療藥物[1-4],已成為生物醫(yī)藥領域發(fā)展的最熱門方向[5]。而單克隆抗體作為復雜的蛋白大分子藥物,不但相對分子質量大,而且還存在蛋白翻譯后修飾,因此藥物的質量控制是其研發(fā)和生產(chǎn)過程中不容忽視的環(huán)節(jié)[6],也成為全球藥品監(jiān)管機構關注的熱點[5]。其中,單克隆抗體藥物的含量測定是其質量控制中一個重要參數(shù),準確的含量測定對單克隆抗體藥物殘留雜質的限量控制、比活性的計算及產(chǎn)品的分裝等環(huán)節(jié)均具有重要意義[7]。表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR) 是一種物理光學現(xiàn)象[8-9],由Wood在1902年首次發(fā)現(xiàn)[10],近年來逐步成為生化分析領域重要的分析手段和研究工具[11]。SPR法可檢測出幾乎所有的生物大分子物質,廣泛應用于蛋白質組學、細胞生物學和藥物研發(fā)等領域的研究[12]。

    Protein A(Staphylo coccal Protein A)來源于金黃色葡萄球菌,可以與IgG的Fc片段發(fā)生特異性的結合反應[13]。因此,本研究采用Protein A芯片,利用Protein A可以與IgG的Fc片段發(fā)生結合的特性,基于SPR技術建立一種高通量的快速、簡便、準確的測定單克隆抗體含量的方法。

    1 材料與方法

    1.1儀器與試劑 生物分子相互作用分析儀(BIAcore T200,GE公司);S系列Protein A芯片(GE公司,批號:10268296);10×HBS緩沖液(GE公司,批號BCBV7063);Surfactant P20(GE公司,批號:8072939);10 mmol·L-1pH值1.5鹽酸甘氨酸緩沖液(GE公司,批號:10259550);人IgG1對照品(Abcam公司,批號:GR3218380-4);RPMI1640無血清培養(yǎng)基(Gibco公司,批號:1991640);單抗Mab1(江蘇某制藥公司,批號:B20180912)。

    1.2方法建立與優(yōu)化 將儀器溫度設置為25 ℃,待儀器溫度穩(wěn)定后,將樣品以10 μL·min-1的流速注入儀器,樣品與Protein A芯片結合時間設為30 s,讀取Ru值。上樣結束后,以pH值1.5、濃度10 mmol·L-1鹽酸甘氨酸溶液以30 μL·min-1的流速再生30 s。

    1.3方法驗證

    1.3.1專屬性考察 本研究考察了空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基及上樣緩沖液(1×HBS緩沖液)對抗體測定是否有影響。將單抗Mab1溶液、人IgG1對照品以1×HBS緩沖液分別稀釋至1 000 ng·mL-1,空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基、上樣緩沖液(1×HBS緩沖液)按同樣條件進行稀釋,按照建立的方法進行檢測分析,考察空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基及上樣緩沖液是否對抗體檢測有干擾,確定方法的專屬性。

    1.3.2線性范圍 取人IgG1對照品,以1×HBS緩沖液依次稀釋至20 000,10 000,5000,2000,1000,500,200,100,50,20 ng·mL-1按照建立的方法進行檢測分析,每個濃度測試3次,以人IgG對照品濃度為橫坐標,以響應值(RU)值為縱坐標,繪制標準曲線,確定線性范圍。

    1.3.3檢測限及定量限 以0濃度的抗體樣品對應的平均Ru值作為儀器噪音,以信噪比3:1對應的抗體濃度作為該方法的檢測限,以信噪比10:1對應的抗體濃度作為該方法的定量限。

    1.3.4準確度 取人IgG1對照品,以空白輔料緩沖液分別稀釋至高、中、低(5000,500,50 ng·mL-1) 濃度,每個濃度平行制成3份,按照建立的方法進行檢測分析,計算每個準確度溶液濃度及回收率。

    取IgG對照品,以RPMI1640無血清培養(yǎng)基分別稀釋至高、中、低(5000,500,50 ng·mL-1) 濃度,每個濃度平行制成3份,按照建立的方法進行檢測分析,計算每個準確度溶液濃度及回收率。

    1.3.5重復性實驗 取單抗Mab1溶液以1×HBS緩沖液稀釋至高、中、低(5000,500,50 ng·mL-1) 濃度,每個濃度平行制成3份,按照建立的方法進行檢測分析,計算樣品的平均濃度及RSD值。

    1.3.6中間精密度實驗 由兩名不同實驗人員A、B各自獨立操作,分別取單抗Mab1溶液稀釋至1000 ng·mL-1,按照建立的方法進行檢測分析,各重復檢測6次,計算樣品的平均濃度及變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。

    1.3.7耐用性 取單抗Mab1溶液稀釋至1000 ng·mL-1,通過計算流速改變(8,10,12 μL·min-1),結合時間改變(25,30,35 s)以及樣品處理后室溫放置不同時間(0,2,4,6,8 h)后進行檢測,計算得出樣品平均濃度及RSD值。

    2 結果

    2.1方法建立與優(yōu)化 在建立基于SPR技術的抗體濃度測定方法時,需要考慮的參數(shù)主要有上樣速度、結合時間及再生條件。上樣速度及結合時間兩個參數(shù)共同影響建立的方法檢測抗體濃度的線性范圍。適宜的再生條件則需滿足每次再生將Protein A結合的抗體分析物全部洗脫下來并不影響芯片表面Protein A結合抗體Fc端的活性。經(jīng)過摸索,建立的檢測方法條件如下:儀器溫度設置為25 ℃,上樣速度為10 μL·min-1,結合時間為30 s,芯片再生條件為以pH值1.5濃度為10 mmol·L-1的鹽酸甘氨酸溶液以30 μL·min-1的流速再生30 s。

    2.2專屬性考察 見圖1,IgG1對照品、Mab1抗體溶液均與Protein A芯片產(chǎn)生結合信號,空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基、上樣緩沖液均無結合信號。結果表明空白輔料溶液、RPMI1640無血清培養(yǎng)基均與Protein A芯片無非特異性結合,對抗體檢出無干擾,該方法專屬性強。

    2.3線性范圍 以人IgG1對照品濃度為橫坐標,以相應單位(Ru)為縱坐標作圖,繪制標準曲線。結果表明,抗體濃度在20~20 000 ng·mL-1的范圍內(nèi),響應單位(RU)與IgG1濃度呈現(xiàn)良好的線性關系,R2為1,見圖2。

    2.4檢測限及定量限 經(jīng)實驗,0濃度抗體樣品平均Ru值為0.14,以0.14作為儀器的噪音。以儀器3倍噪音對應的抗體濃度作為此方法的檢測限,以儀器10倍噪音作為此方法的定量限。經(jīng)計算,該方法的檢測限為2.07 ng·mL-1,定量限為11.16 ng·mL-1。

    2.5準確度 以空白輔料溶液稀釋人IgG1對照品,按照建立的方法進行檢測分析的結果見表1。經(jīng)計算,人IgG1對照品5000,500,50 ng·mL-1高中低3個濃度在空白輔料中回收率分別為102.68%,102.68%,99.26%,9份樣品平均回收率為101.54%,RSD值2.23%。以RPMI1640無血清培養(yǎng)基溶液稀釋人IgG1對照品,按照建立的方法進行檢測分析的結果見表2。

    圖1 專屬性考察結果

    圖2 方法線性范圍考察結果

    Fig.2Theanalysisresultsoflinearrangeofthemethod

    表1 空白輔料加標回收率

    Tab.1TherecoveryrateofIgG1standardinblankexcipient

    空白輔料加標濃度實測濃度( ng·mL-1)回收率平均回收率%50005172.46103.45102.685089.78101.805139.26102.79500510.42102.08102.68512.49102.50517.36103.475049.2798.5499.2648.3696.7251.26102.52

    經(jīng)計算,5000,500,50 ng·mL-1人IgG1對照品在RPMI1640無血清培養(yǎng)基中的回收率分別為105.07%,100.88%,96.22%,9份樣品平均回收率為100.72%,RSD值4.23%。上述結果表明,該方法加標回收率好,準確度高。

    表2 RPMI1640無血清培養(yǎng)基加標回收率

    Tab.2TherecoveryrateofIgG1standardinRPMI1640medium(serumfree)

    RPMI1640無血清培養(yǎng)基加標濃度實測濃度( ng·mL-1)回收率平均回收率%50005232.36104.65105.075219.27104.395309.13106.18500488.9097.78100.88514.35102.87509.96101.995046.9293.8496.2249.2498.4848.1796.34

    2.6重復性實驗 取單抗Mab1溶液以1×HBS緩沖液稀釋至高、中、低(5000,500,50 ng·mL-1)濃度,每個濃度平行檢測3次,經(jīng)計算,5000,500,50 ng·mL-1單抗Mab1樣品重復性所得RSD分別為2.04%,2.37%,2.27%(表3)。表明該方法重復性好。

    2.7中間精密度 兩名不同實驗人員各重復檢測6次,結果見表4,經(jīng)計算,變異系數(shù)為0.49%。表明該方法中間精密度高。

    表3 重復性實驗結果

    Tab.3Theanalysisresultsofrepeatabilitytest

    樣品濃度實測濃度(ng·mL-1)RSD/%50005092.532.045219.225303.71500523.792.37526.64504.075048.722.2747.9750.16

    表4 中間精密度實驗結果

    Tab.4Theanalysisresultsofintermediateprecisionng·mL-1

    實驗人員123456A1043.631041.771038.071040.851038.071039.92B1038.241035.281039.461052.421034.361032.68

    2.8耐用性 本研究考察了流速(8,10,12 μL·min-1),結合時間(25,30,35 s)以及樣品處理后室溫放置不同時間(0,2,4,6,8 h)等條件的微小改變對檢測結果的影響。結果顯示:流速改變檢測結果平均值為1005.01 ng·mL-1,RSD值為4.39%;結合時間改變檢測結果平均值為993.40 ng·mL-1,RSD值為6.03%;樣品處理后室溫放置0~8h之內(nèi),檢測結果平均值為1017.12 ng·mL-1,RSD值為2.64%(表5)。結果表明,該方法耐用性好,實驗條件微小改變對檢測結果無影響,抗體Mab1溶液在8h之內(nèi)保持穩(wěn)定。

    3 討論

    抗體藥物作為一種大分子藥物,由于其結構的高度復雜性,對其產(chǎn)品的質量控制和管理更加嚴格??贵w含量測定為抗體藥物質量控制及抗體表達株篩選、評價的一個重要參數(shù)。目前,常用的單抗藥物含量測定方法有消光系數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法等,但是這些方法尚存在一些不足,如易受樣品基質干擾、樣品前處理復雜、方法靈敏度低、重復性差、定量范圍窄等。不能滿足抗體藥物質量控制的高要求[6,14]。近年來,一些新的檢測方法也被用于抗體含量的測定。鄧春平等[15]建立了一種均相時間分辨熒光法(HTRF)用于單克隆抗體含量的測定,該方法抗體含量測定范圍為25~1000 ng·mL-1,線性相關系數(shù)在0.99以上,平均回收率為98.9%。該方法將熒光共振能量轉移技術(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)與時間分辨熒光技術(time-resolved fluorescence,TRF)兩者的優(yōu)點結合起來,建立了一種高靈敏度、高通量的抗體含量測定方法。但該方法需要對抗原進行標記,樣品前處理復雜,同時需要用到鑭系元素(如Eu)標記的抗人IgG(Fc)的抗體,限制了該技術的應用。曾秀引等[6]建立了一種采用生物膜干涉技術(bio-layer interferometry,BLI)的高通量抗體濃度快速檢測方法,線性范圍0.781~400 μg·mL-1,準確度范圍94.46%~114.00%。但該方法線性范圍窄、定量限較高(1 μg·mL-1),不能用于低濃度抗體樣品的濃度測定,限制了該檢測技術的應用范圍,不適用于表達量較低單克隆抗體細胞株前期篩選工作。本研究利用表面等離子共振技術建立的單克隆抗體藥物濃度測定方法,專屬性好,重復性好,準確度高,耐用性強并且檢測線性范圍較寬。該方法在空白輔料及RPMI1640無血清培養(yǎng)基中3個濃度水平平均回收率較高,方法不易受到樣品基質影響,對樣品基質要求較低。因此,相比較于傳統(tǒng)的消光系數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法等,本法具有以下優(yōu)勢:樣品處理簡單,僅需要經(jīng)過濾過、稀釋、離心等步驟即可直接上機檢測,簡化實驗流程,提高實驗效率。同時該方法線性范圍寬(20~20 000 ng·mL-1),檢測限(2.07 ng·mL-1)及定量限低(11.16 ng·mL-1),既適用于單克隆抗體藥物制劑、中間品樣品的含量測定又適用于單克隆抗體發(fā)酵上清等樣品中抗體濃度測定。另外,BIAcore T200支持96和384孔板,可實現(xiàn)抗體濃度的高通量測試,因此也特別適合單克隆抗體細胞株篩選階段大批量抗體樣品濃度的檢測及評估。

    表5 耐用性考察結果

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