響應(yīng)面法優(yōu)化提取南方紅豆杉黃酮的工藝研究*

王昱霽 朱婉萍

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

本研究利用微波輔助法，提取南方紅豆杉枝葉中的黃酮類化合物，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以期獲得較高的提取得率。為后續(xù)研究南方紅豆杉中的黃酮類化合物或其他有效成分，為提高南方紅豆杉資源的綜合利用率提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：南方紅豆杉枝葉（寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司提供），清洗曬干粉碎并過(guò)50目篩；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑，均為分析純級(jí)。MAS-II PLUS微波萃取工作站（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV1800型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（島津）；MS204分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[1]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取在105℃下干燥至質(zhì)量恒定的10mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于25ml容量瓶中，用65%乙醇溶液溶解并定容，配制成濃度為0.4mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別置于10ml容量瓶中，各加65%乙醇至5ml，依次加入 5%NaNO2溶液 0.3ml，搖勻，放置 6min；加 10%Al(NO3)3溶液0.3ml，搖勻，放置6min；加入4%NaOH溶液4ml，搖勻，放置15min，再定容至10ml。以不加蘆丁對(duì)照品溶液同法操作得到的溶液作為空白對(duì)照，全波段掃描，找到吸收度最大波長(zhǎng)，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。

1.3 南方紅豆杉總黃酮的提取和吸光度測(cè)定：稱取粉碎并過(guò)50目篩的南方紅豆杉粉末5g，裝入四頸瓶，加入不同濃度的乙醇溶液為溶劑，在不同提取條件下，利用微波萃取工作站進(jìn)行微波輔助提取，提取后離心（2500 r/min，10min），取上清，補(bǔ)足加入溶劑的量后，得到南方紅豆杉總黃酮待測(cè)液。將提取所得的每份樣液，分別取0.5ml，按“1.2”方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和加入的提取溶劑體積計(jì)算南方紅豆杉總黃酮提取得率。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以南方紅豆杉總黃酮提取得率為指標(biāo)，在固定其他實(shí)驗(yàn)條件的情況下，分別考察乙醇濃度、微波時(shí)間、微波功率、提取溫度和料液比對(duì)南方紅豆杉黃酮提取得率的影響。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取液中的總黃酮含量，根據(jù)南方紅豆杉總黃酮的提取得率，考察分析微波萃取中單個(gè)因素的影響。

1.4.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響：按“1.3”操作方法，固定條件：微波時(shí)間10min，微波功率450W，提取溫度60℃，液料比30ml/g，分別考察乙醇濃度為55%、60%、65%、70%、75%對(duì)總黃酮提取得率的影響。

1.4.2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響：按“1.3”操作方法，固定條件：乙醇濃度60%，微波功率450W，提取溫度60℃，液料比30ml/g，分別考察微波時(shí)間為5、10、15、20、25、30min對(duì)總黃酮提取得率的影響。

1.4.3 微波功率對(duì)總黃酮提取得率的影響：按“1.3”操作方法，固定條件：乙醇濃度60%，微波時(shí)間10min，提取溫度60℃，液料比30ml/g，分別考察微波功率為250、350、450、550、650、750W對(duì)總黃酮提取得率的影響。

1.4.4 提取溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響：按“1.3”操作方法，固定條件：乙醇濃度60%，微波時(shí)間10min，微波功率450W，液料比30ml/g，分別考察提取溫度為40、50、60、65、70、75、80℃對(duì)總黃酮提取得率的影響。

1.4.5 液料比對(duì)總黃酮提取得率的影響：按“1.3”操作方法，固定條件：乙醇濃度60%，微波時(shí)間10min，微波功率450W，提取溫度60℃，分別考察料液比為10、20、30、40、50ml/g對(duì)總黃酮提取得率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化南方紅豆杉總黃酮提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇微波時(shí)間、提取溫度和料液比為自變量，運(yùn)用Design Expert 6.0.1軟件按照Box-Behnken設(shè)計(jì)方法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面法分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合二次回歸方程，得到微波輔助提取總黃酮的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析作圖；響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用Design-expert 6.0.1軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線：全波段掃描得出的最大吸收波長(zhǎng)為：508nm；以吸收度(A)為縱坐標(biāo)，溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中蘆丁的質(zhì)量與吸光度擬合的回歸方程為：吸光度A=11.985C+0.0277，R2=0.9997。結(jié)果表明，蘆丁在質(zhì)量為0.0206～0.206mg時(shí)與其吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：分述如下。

2.2.1 乙醇濃度對(duì)紅豆杉總黃酮提取得率的影響：隨著乙醇濃度的升高，總黃酮的提取得率先增加后降低，當(dāng)提取溶劑為65%乙醇時(shí)，總黃酮得率最高，表明65%乙醇溶液的極性最適合提取南方紅豆杉中的黃酮類成分。

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)紅豆杉總黃酮提取得率的影響：在微波時(shí)間5～20min間，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮的提取得率增大；在20min后，提取得率迅速下降。原因可能是當(dāng)微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)造成黃酮結(jié)構(gòu)的破壞或者是其活性成分的損失因而造成總黃酮得率的下降，因此最佳的微波時(shí)間為20min。

2.2.3 微波功率對(duì)紅豆杉總黃酮提取得率的影響：隨著微波功率的升高，總黃酮的提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)微波功率為550W時(shí)總黃酮的提取得率最高。

2.2.4 提取溫度對(duì)紅豆杉總黃酮提取得率的影響：在提取溫度40～60℃之間，隨著溫度的升高，總黃酮的提取得率增大；在60～80℃之間，總黃酮的提取得率迅速下降。因此，提取溫度為60℃總黃酮的提取效果最好。

2.2.5 液料比對(duì)紅豆杉總黃酮提取得率的影響：隨著液料比的增大，總黃酮的提取得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。說(shuō)明液料比在10～30ml/g范圍內(nèi)，溶液體積越大，總黃酮溶解的越多。但是當(dāng)溶劑含量過(guò)大時(shí)，溶劑對(duì)微波的能量吸收增加，導(dǎo)致細(xì)胞液對(duì)微波能量的吸收減少，造成細(xì)胞破壁不完全，黃酮類物質(zhì)不能充分溶出，從而使其含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，液料比為30ml/g時(shí)總黃酮的提取得率最高。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：具體如下。

2.3.1 建立模型：在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken組合設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取得率為響應(yīng)值（Y），利用Design Expert 6.0.1軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，共進(jìn)行17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中包含12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，12個(gè)析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用以考察微波時(shí)間、提取溫度、料液比3個(gè)因素對(duì)微波提取總黃酮含量的影響是否顯著，5次零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用作誤差估計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn)：利用Design Expert 6.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后，得到模型的二次多項(xiàng)式回歸方程如下：

Y=4.58+0.070A-0.035B+0.062C-0.006325AB-0.00965AC-0.066BC-0.15A2-0.12B2-0.061C2。

由表3回歸方差分析結(jié)果可以看出，模型的失擬項(xiàng)不顯著，P=0.0886＞0.05，響應(yīng)面的回歸模型極顯著，P＜0.01，回歸方程R2=0.9661＞0.9，說(shuō)明該模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)擬合較好[2]，能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，所以，可以利用此回歸方程確定南方紅豆杉枝葉中總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波功率550W，提取溫度60.29℃，提取時(shí)間20.60min，液料比31.59ml/g；在此條件下提取的總黃酮得率為4.59806%。

從表3還可以看出回歸模型中因素A、C的P＜0.01，表明微波時(shí)間、提取溫度對(duì)東北紅豆杉枝葉總黃酮得率影響極顯著，而因素B的影響顯著（P＜0.05），且影響總黃酮得率的因素主次為微波時(shí)間(A)＞提取溫度(C)＞液料比(B)；而因素交互項(xiàng)BC影響極顯著，二次項(xiàng)A2、B2影響極顯著，C2影響顯著，說(shuō)明各因素對(duì)紅豆杉枝葉總黃酮得率不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，存在著交互影響；交互項(xiàng)AB、AC對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05），即微波時(shí)間與提取溫度、微波時(shí)間與液料比之間交互作用不顯著。

表3 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化：根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，分析微波時(shí)間、提取溫度和料液比等因素及其交互作用對(duì)微波輔助提取總黃酮得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 總黃酮提取得率=f（A，B）響應(yīng)曲面圖（C=35ml/g）

圖2 總黃酮提取得率=f（A，C）響應(yīng)曲面圖（B=60℃）

圖3 總黃酮提取得率=f（B，C）響應(yīng)曲面圖及等高線圖（A=20min）

通過(guò)響應(yīng)面的坡度陡峭程度和等高線圖橢圓形狀可以直觀反映出兩個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱程度。由圖1～圖3可知，微波時(shí)間與提取溫度、微波時(shí)間與液料比的交互作用不顯著，與上述方差分析和顯著性檢驗(yàn)相符。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：為了驗(yàn)證回歸模型預(yù)測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致，結(jié)合考慮響應(yīng)面優(yōu)化所得的最佳工藝條件和實(shí)際操作的可行性，選擇工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波功率550W，微波時(shí)間21min，提取溫度60℃，液料比32ml/g。對(duì)得到的最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，分別得到南方紅豆杉枝葉總黃酮得率實(shí)際值4.5951%、4.6036%、4.5833%，平均值4.5940%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面軟件分析得出的理論值接近，且測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

近年來(lái)研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化等作用[3]。目前，對(duì)紅豆杉中黃酮類化合物提取工藝優(yōu)化的報(bào)道較少。本文以南方紅豆杉枝葉為原料，采用微波輔助提取南方紅豆杉總黃酮，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上以總黃酮提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)曲面法分析對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波功率550W，微波時(shí)間21min，提取溫度60℃，液料比32ml/g。在此條件下提取1次的總黃酮得率為4.5940%。使用響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助法提取南方紅豆杉黃酮的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，工藝穩(wěn)定可行，可為后續(xù)研究南方紅豆杉各種有效成分提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；為開(kāi)辟南方紅豆杉新用途、擴(kuò)大其藥用范圍提供參考依據(jù)。