加味竹葉石膏湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠Toll樣受體抗炎作用的機(jī)制研究*

舟山醫(yī)院 浙江 舟山 316021

痛風(fēng)是由單鈉尿酸鹽晶體誘發(fā)的炎癥性疾病[1]。加味竹葉石膏湯臨床上治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型痛風(fēng)，并取得了顯著的效果。本研究旨在通過觀察加味竹葉石膏湯在大鼠痛風(fēng)模型中的應(yīng)用效果，及對Toll樣受體（TLR）、炎癥相關(guān)因子水平的變化，從而探討其抗炎作用機(jī)制。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取清潔級SD大鼠90只（江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0027），雄性，體質(zhì)量180±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組18只。所有大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室中，溫度20±2℃，濕度60%～70%，光暗周期（12h/12h）每4只大鼠一籠自由活動(dòng)。

1.2 研究方法：分述如下。

1.2.1 動(dòng)物造模：模型誘導(dǎo)方法：分組后，除空白組，其余4組小鼠經(jīng)2.5%異氟烷麻醉后，以碘酒、乙醇消毒局部，用1ml滅菌注射針在小鼠右側(cè)距小腿(踝關(guān)節(jié)背側(cè)，從45°方向插入至脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將含0.5mg尿酸鈉溶液20μl注入到關(guān)節(jié)腔，正常對照組注射20μl磷酸緩沖鹽溶液（PBS），4天后處理小鼠，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.2 中藥配置和給藥劑量：加味竹葉石膏湯組成：淡竹葉、麥門冬各12g，生石膏、薏苡仁各30g，知母、半夏各10g，北沙參、土茯苓各15g，甘草6g。除生石膏外其余藥物冷水浸泡30分鐘，武火煎煮至沸騰狀態(tài)后改文火煎煮30分鐘，濾出藥汁后加水復(fù)煎30分鐘，將2次藥汁混合共800ml。成人藥量低劑量為150ml/次，中劑量為200ml/次，高劑量為250ml/次，根據(jù)70kg人與200g大鼠藥物劑量換算標(biāo)準(zhǔn)，低劑量組為2.68ml/次，中劑量組為3.57ml/次，高劑量組為4.46ml/次，每日早、中、晚各1次。模型組同期給予約3.5ml0.9%氯化鈉溶液，空白組不給予任何藥物。

1.2.3 觀察指標(biāo)：所有大鼠在造模96h后（禁食不禁水12h）腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg進(jìn)行麻醉，取腹主動(dòng)脈血3ml靜置1h后，離心取上清液，置于-20℃冰箱中保存待檢。血液收集完成后，脫頸處死，取受試關(guān)節(jié)于4%多聚甲醛中固定，7d后進(jìn)行脫鈣處理。血液檢測指標(biāo)包括血清尿酸（BUA）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6），均采用ELISA檢測，受試關(guān)節(jié)脫鈣處理后取組織切片、HE染色后采用免疫組化法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有檢測結(jié)果均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血液檢測結(jié)果比較：與空白組相比，其他各組BUA、IL-1β、IL-6水平均增高（P＜0.05）；與模型對照組相比，治療后低、中、高劑量治療組BUA、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；與低、中劑量組相比，高劑量治療組IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；低、中劑量組治療后IL-1β、IL-6水平無明顯差異（P＞0.05）；低、中、高劑量治療組治療后BUA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血液檢測結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

IL-6（pg/ml）34.82±10.05 69.30±6.42*65.31±5.48*△64.02±4.27*△55.32± 7.18*△▲組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組BUA（μmol/L）193.21±22.45 280.14±30.95*234.14±19.02*△220.29±11.16*△223.05±11.10*△IL-1β（pg/ml）3.01±1.54 5.23±1.30*4.97±1.29*△4.92±1.52*△4.46±1.23*△▲

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較：與空白組相比，其他各組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平均增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，治療后低、中、高劑量治療組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低、中劑量組相比，高劑量組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低、中劑量組治療后TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組TLR2 TLR4例數(shù)18 18 18 18 18 TLR4蛋白表達(dá)1.02±0.37 3.67±0.61*3.02±0.25*△2.79±0.30*△2.58±0.21*△▲陽性細(xì)胞（%）11.02±2.48 35.68±7.62*30.01±2.73*△28.42±2.76*△27.35±2.08*△▲染色強(qiáng)度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2 TLR2蛋白表達(dá)1.21±0.28 3.53±0.78*2.99±0.31*△2.91±0.29*△2.72±0.19*△▲陽性細(xì)胞（%）10.29±4.59 36.34±5.79*30.38±2.49*△28.73±3.35*△26.52±1.93*△▲染色強(qiáng)度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2

3 討論

痛風(fēng)中醫(yī)學(xué)中可歸屬于“熱痹”范疇，主要與素體稟賦不足，或調(diào)攝不慎，長期嗜欲膏粱厚味，日久導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失常，濕熱內(nèi)蘊(yùn)有關(guān)。本病有別于一般“痹病”之風(fēng)寒濕邪入侵，故治宜清熱化濕的同時(shí)，兼顧健脾養(yǎng)陰?！秱摗分袢~石膏湯方中石膏、竹葉清熱除煩，人參、麥冬益氣養(yǎng)陰，半夏降逆，粳米和中。由于痛風(fēng)發(fā)病和濕熱內(nèi)聚、脾失健運(yùn)密切相關(guān)，故將原方人參易為北沙參，去粳米加用薏苡仁、土茯苓，重在清熱瀉火、養(yǎng)陰除煩同時(shí)兼顧健脾和中、滲濕化濁。古方新用，具有清補(bǔ)兩顧、清熱兼健脾、補(bǔ)虛不戀邪的特點(diǎn)，適用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱蘊(yùn)結(jié)型。

研究表明，在諸多炎癥因子中，IL-1β已成為痛風(fēng)發(fā)病過程中的關(guān)鍵因子，對于痛風(fēng)炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用[1]。痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)已形成微晶體沉淀，而該沉淀物的來源為尿酸鈉[2-3]，Toll樣受體作為組織細(xì)胞表面的感應(yīng)器，對尿酸鈉微晶體具有較高的敏感性，可迅速激活免疫應(yīng)答，通過一系列細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞活化、細(xì)胞激活等作用，最終啟動(dòng)IL-1β的表達(dá)，使炎癥反應(yīng)逐漸加劇，并出現(xiàn)炎癥臨床表現(xiàn)。因此從理論上分析，Toll受體相關(guān)因子水平可提示尿酸鈉微晶體的沉積量是否足以引發(fā)痛風(fēng)癥狀，其中TLR2、TLR4是Toll受體的代表因子，目前已有研究證實(shí)TLR2、TLR4與痛風(fēng)癥狀的發(fā)生及緩解有直接的關(guān)系[4]。

我們既往的研究顯示，加味竹葉石膏湯能夠通過NLRP3炎癥信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用，抑制TNF-α、Caspase-1等炎癥因子的水平，顯著改善關(guān)節(jié)腫脹程度和炎癥指數(shù)[5-6]。為進(jìn)一步探討加味竹葉石膏湯在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的抗炎作用機(jī)制，本次研究對痛風(fēng)模型大鼠Toll受體相關(guān)因子及炎性因子進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示痛風(fēng)急性發(fā)作后在血尿酸、IL-1β和IL-6水平升高的同時(shí)，以TLR2、TLR4為代表的Toll受體陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)也隨之升高，這與Toll受體對尿酸升高后尿酸鈉沉積微晶體的敏感性有關(guān)。通過加味竹葉石膏湯治療后，大鼠BUA、IL-1β和IL-6水平降低，并且TLR2、TLR4的陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)也明顯降低，由此提示加味竹葉石膏湯對于改善急性痛風(fēng)大鼠BUA水平及炎性反應(yīng)有顯著的效果，其作用機(jī)理與Toll免疫應(yīng)答機(jī)制有關(guān)，以目前的研究結(jié)果推測，加味竹葉石膏湯可抑制關(guān)節(jié)滑膜腔中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)，減少尿酸鈉微晶體的堆積，從而起到緩解炎癥反應(yīng)的效果。而通過對不同劑量加味竹葉石膏湯的作用效果比較，較高劑量藥物作用在短期內(nèi)效果更佳。

由此，筆者認(rèn)為在痛風(fēng)急性期應(yīng)用加味竹葉石膏湯具有可行性和有效性，而且作用機(jī)制與Toll受體的免疫應(yīng)答有密切的關(guān)系。