骨性關(guān)節(jié)炎動物模型研究進(jìn)展

夏夢熊, 韓海慧, 梁倩倩, 翟偉韜, 徐 浩

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 上海 200052;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院, 脊柱病研究所,教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性疾病，其全球患病率在不斷上升。目前該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。OA 的動物模型是研究該病發(fā)病機(jī)制、預(yù)防干預(yù)、治療研究的重要手段。針對OA 的發(fā)病特點(diǎn)，目前采用的造模方案主要分為轉(zhuǎn)基因模型和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型兩種，在這兩大類下又根據(jù)研究的側(cè)重點(diǎn)形成多種操作方法。各造模方案均有其優(yōu)點(diǎn)及局限性，故本文針對OA 造模方案進(jìn)行歸納、分析、整理，綜述如下。

1 OA 的動物模型分類

基于OA 疾病的發(fā)病原因，OA[1]通常被分為原發(fā)性O(shè)A(primary osteoarthrosis, POA)和繼發(fā)性O(shè)A(posttraumatic osteoarthritis, PTOA)。POA 是由于關(guān)節(jié)的退行性變化引起的自發(fā)現(xiàn)象，而PTOA 是由危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥，包括創(chuàng)傷、先天性疾病和其他疾病、代謝紊亂或骨骼丟失[2]。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物造模時，應(yīng)根據(jù)所研究的方向選擇合適的動物模型(圖1)。POA 模型主要為轉(zhuǎn)基因模型和自發(fā)性模型。轉(zhuǎn)基因模型是通過基因敲除的方式使動物的OA 易感性增加，自發(fā)性模型則指未經(jīng)任何人工處置，在自然條件下發(fā)生或由于基因突變的異常表現(xiàn)通過遺傳育種保留下來的動物模型。實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)模型通常需要對關(guān)節(jié)外部進(jìn)行破壞，從而營造出類似于人類創(chuàng)傷后OA 發(fā)病的情況。隨著研究的深入，非侵入模型越來越多進(jìn)入我們的視野。我們將在以下部分中討論這些模型的優(yōu)缺點(diǎn)。

2 POA 模型

POA 模型主要為轉(zhuǎn)基因模型和自發(fā)性模型。自發(fā)性模型指不借助手術(shù)、藥物注射等人為操作就能發(fā)病的動物模型。某些動物的疾病發(fā)展較為緩慢,如小鼠、豚鼠、犬，兔和馬等，這類動物和人類POA的緩慢進(jìn)展類似，通常用于自發(fā)性O(shè)A 模型的研究。此外，各種轉(zhuǎn)基因小鼠模型同樣無需手術(shù)干預(yù)就能形成OA。由于自發(fā)性模型動物需要長期觀察其骨贅或軟骨變化，確保其疾病發(fā)展過程更加類似于人類POA的發(fā)展過程，所以動物實(shí)驗(yàn)的周期會增加，很難進(jìn)行短期實(shí)驗(yàn)。且實(shí)驗(yàn)動物的成本也相應(yīng)提高，如飼養(yǎng)費(fèi)用和場所費(fèi)用等，這也給研究帶來了一定的困難。這是自發(fā)性模型比較突出的一個問題。

圖1 OA 的分類及造模方式

2.1 轉(zhuǎn)基因動物模型

小鼠模型在OA 研究中的主要優(yōu)點(diǎn)是易于進(jìn)行遺傳修飾。模型中單個基因的丟失或突變，如Ⅸ型膠原蛋白(c o l I X)[3]、Ⅱ型膠原纖維α1(col2α1)、Ⅺ型膠原纖維 α1(col11α1)、聚集蛋白聚糖、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT-1-MMP)[4]和血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶5(ADAMTS5)，可導(dǎo)致類似于OA 患者的軟骨退化。更具體地說，軟骨細(xì)胞的破壞會導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的形成和重塑的中斷[5-6]。近期研究[7]顯示，在Dot1 基因敲除小鼠可觀察到OA 的易感性增加，實(shí)驗(yàn)同時表明增加小鼠體內(nèi)的Dot1 活性可預(yù)防OA 的發(fā)生，并延緩疾病進(jìn)展。

富含亮氨酸重復(fù)序列的小分子蛋白多糖(SLRP)是與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、膠原蛋白和其他分子結(jié)合的細(xì)胞外分子。在體外，SLRP可以顯示調(diào)節(jié)膠原纖維的形成。二聚糖(BGN)和纖維調(diào)節(jié)素(FM)是兩種最突出、表達(dá)最為廣泛的SLRP。環(huán)化重組酶 Cre-loxP[locus of X (cross)overin P1]位于編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)受體1a(Bmpr1a)的基因側(cè)翼。編碼生長分化因子5(Gdf5)基因的啟動可以消除該BMP受體并指導(dǎo)Cre表達(dá)[8]。因此，Cre-Gdf5/Bmpr1afloxP這種條件性敲除小鼠不能在關(guān)節(jié)發(fā)育過程中選擇性地產(chǎn)生BMP1a型受體[9-11]。B G N 缺陷型小鼠、FM 缺陷型小鼠、BGN/FM 雙敲除小鼠和Cre-Gdf5/ Bmpr1afloxP小鼠關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)得更早也更加嚴(yán)重。P t c h 1+/-、Col2A1-Gli2、COL2-rtTA-Cre、Gt(ROSA)26Sortm1(Smo/YFP)AM 轉(zhuǎn)基因小鼠也被用于OA發(fā)展進(jìn)程研究。其中，Col2A1-Gli2 轉(zhuǎn)基因小鼠在軟骨細(xì)胞中的C o l 2 A 1 調(diào)節(jié)元件下過表達(dá)hedgehog(Hh)激活轉(zhuǎn)錄因子Gli2[12]。Gt(ROSA)26Sortm1(Smo/YFP)AM 轉(zhuǎn)基因小鼠通過Cre 介導(dǎo)的重組表達(dá)平滑受體SMO同源蛋白(SmoM2)的成型活化W539L點(diǎn)突變。當(dāng)在多西環(huán)素給藥下將該突變小鼠與COL2-rtTA-Cre 小鼠雜交時，SmoM2在軟骨細(xì)胞中表達(dá)。其他突變小鼠如TNF轉(zhuǎn)基因小鼠就會產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞，并出現(xiàn)骨贅和軟骨下骨僵硬[13]。

2.2 自發(fā)性模型

目前研究OA 自發(fā)性模型的重點(diǎn)聚焦在小型動物上, 例如STR/ORT 小鼠、C57BL/6 和BALB/c小鼠[14]。小鼠用于檢查軟骨退化[15]，包括軟骨基質(zhì)中糖胺聚糖的損失，Ⅱ型膠原降解[16]，軟骨細(xì)胞中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和糖合成的干擾，以及半月板前段游離邊緣的不規(guī)則性。交叉韌帶膠原代謝速度會加快[17]，且小鼠會在晚期出現(xiàn)步態(tài)的退化[18]。小鼠模型缺乏形態(tài)學(xué)變化，例如軟骨基質(zhì)的纖維化，軟骨細(xì)胞聚集，骨贅形成或炎癥，這些形態(tài)改變都很難在小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)觀察到，其原因可能是小型動物關(guān)節(jié)較小、關(guān)節(jié)修復(fù)能力差。

自然界中同樣存在一些動物隨著年齡的增長會自然出現(xiàn)OA 的病理表現(xiàn)，既不需要使用基因修飾手段，也不需要進(jìn)行外科手術(shù)操作對其關(guān)節(jié)進(jìn)行破壞。長壽命的動物可以通過年齡增長自然地發(fā)生OA，因此認(rèn)為獼猴模型適用于軟骨膠原變化的研究。形態(tài)學(xué)研究表明，猴和人類一樣，OA 發(fā)病的特征在于軟骨細(xì)胞密度的持續(xù)變化，包括鈣(Ca)、磷(P)、鎂(Mg)、硫(S)、鉀(K)、糖胺聚糖(GAG)和膠原蛋白[19]在低齡動物體內(nèi)的增加[20]。猴類動物模型患病率高，且大型動物的關(guān)節(jié)很大，更容易進(jìn)行放射學(xué)和形態(tài)學(xué)研究。但是使用靈長類動物的缺點(diǎn)也很明顯，如成本高、生存環(huán)境因素難控制、道德問題等。

3 PTOA 模型

如前所述，PTOA 是在特定原因或風(fēng)險(xiǎn)因素存在的情況下發(fā)生的。這些原因包括先天性鈣沉積，骨骼、關(guān)節(jié)和代謝疾病。PTOA 由于受影響關(guān)節(jié)的損傷而發(fā)生，我們可以通過直接或間接誘導(dǎo)關(guān)節(jié)損傷引起關(guān)節(jié)炎癥，即：侵入性模型和非侵入性模型。

3.1 侵入性動物模型

3.1.1 手術(shù)模型 Hulth-Telhag模型是最為經(jīng)典的OA 模型，方法為將動物半月板完全切除，并剪短脛骨側(cè)副韌帶[21]。術(shù)后3 周就可以在該模型動物中觀察到II 型膠原的降解[22]。近幾年流行的手術(shù)模型是前交叉韌帶切斷(ACLT)[23]和部分半月板切除模型。髕骨切除與ACLT 的結(jié)合可以在手術(shù)后約2 周加速OA 的發(fā)生并推動其發(fā)展[24]。此外，還有內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定手術(shù)(DMM)[25]，部分內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)(PMM)[26]，內(nèi)側(cè)副韌帶切除和內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)(TMCL/MM)[27]。其中，TMCL/MM可以通過步態(tài)分析檢測出明顯行為學(xué)改變[28]，該模型中關(guān)節(jié)炎癥狀及其修復(fù)過程主要在軟骨和滑膜中發(fā)生。將成年兔前十字交叉韌帶切斷，可以造成結(jié)締組織的成纖維變化，破壞軟骨形態(tài)[29]。Marijinissen 等[30]提出的關(guān)節(jié)劃痕模型通過一次性創(chuàng)傷誘導(dǎo)軟骨退化，且該模型不引起原始模型的滑膜炎癥特征。此方法有效提高了針對軟骨保護(hù)和修復(fù)治療缺陷檢測的靈敏度。此外還可以通過切除大鼠卵巢降低雌激素水平，模擬更年期OA患者的癥狀[31]。

3.1.2 化學(xué)模型 在OA 結(jié)構(gòu)模型中，關(guān)節(jié)中的一個或多個結(jié)構(gòu)組織成分降低。一般來說，該OA 模型基于它們對靶組織或組織成分(例如膠原蛋白、蛋白多糖、軟骨細(xì)胞或滑膜細(xì)胞)的作用被分為不同種別(例如物理、化學(xué)和酶)。內(nèi)分泌調(diào)節(jié)如關(guān)節(jié)內(nèi)皮質(zhì)類固醇給藥，高脂肪飲食或口服喹諾酮類似物可以全身性地促進(jìn)OA 發(fā)展。這些動物模型可以幫助研究OA 的發(fā)病機(jī)制，尤其是在細(xì)胞和分子水平[32]。

化學(xué)改變是指在關(guān)節(jié)腔內(nèi)給予化學(xué)試劑，如加熱劑、固定劑、蛋白質(zhì)變性劑、酸堿或離子溶液，以降解基質(zhì)和淺表關(guān)節(jié)軟骨[33]。對大鼠關(guān)節(jié)注射單碘乙酸可以誘導(dǎo)OA 的疼痛反應(yīng)，造成非?？焖賴?yán)重的骨破壞[34]。

目前用于建立模型最常用的技術(shù)是酶促改變。這類模型可由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和膠原酶誘導(dǎo)的蛋白水解產(chǎn)生[35]。木瓜蛋白酶可以分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，從而降低軟骨彈性及抗壓性，減弱其對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，木瓜蛋白酶分解后產(chǎn)物可刺激滑膜及關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性反應(yīng)，該方法是研究關(guān)節(jié)炎滑膜和軟骨改變進(jìn)展情況的造模方式之一[36]。木瓜蛋白酶模型成模速度快，關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重，難以觀察到骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過程，適用于短期PTOA 的觀察和研究。

3.2 非侵入性動物模型

幾十年來，PTOA 的研究主要使用侵入誘導(dǎo)模型。這些模型在造模過程中需要使用無菌技術(shù)來避免感染，感染引起的炎癥變化會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[32]。這些模型的成功還取決于研究人員在手術(shù)過程當(dāng)中能否在同批次動物身上重復(fù)相同手術(shù)的能力。這些問題都可以通過非侵入模型來解決。非侵入模型對實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的損傷無需外科手術(shù)和物理化學(xué)方法進(jìn)行干預(yù)，這類模型由機(jī)械驅(qū)動對關(guān)節(jié)造成損傷而不會導(dǎo)致皮膚破損，因此就杜絕了手術(shù)過程中感染的可能。另外，因?yàn)閷游锝壎ㄔ诠潭ㄎ恢眠M(jìn)行操作，可以確保同批次造模動物的可重復(fù)性。這些都是非侵入模型的優(yōu)勢所在[38]。

3.2.1 鼠類模型 非侵入性小鼠模型的使用是為了在動物模型中消除人類創(chuàng)傷損傷時可能誘導(dǎo)OA發(fā)病的混雜因素。這類模型可用于OA 研究的早期階段，可能成為開發(fā)PTOA 早期干預(yù)治療的必要條件[40]。小鼠模型的測量手段包括微型計(jì)算機(jī)斷層掃描、對蛋白多糖含量進(jìn)行染色等，這些方法均遵循臨床上對OA 的病理研究標(biāo)準(zhǔn)[41]。聚集蛋白聚糖是軟骨中的主要成分，對關(guān)節(jié)切片進(jìn)行番紅固綠染色顯示番紅染色的丟失，提示蛋白多糖損失[42]，由此來證明軟骨缺損。

非侵入性O(shè)A小鼠模型主要有: ①關(guān)節(jié)脛骨平臺骨折，是非侵入性小鼠模型最早的模型[43]。在該模型中，將麻醉后小鼠的膝蓋彎曲并固定在三角形支架上，利用壓頭提供沖擊力。壓頭會引起關(guān)節(jié)的閉合性骨折，通過調(diào)整壓頭的施加力度可以調(diào)整關(guān)節(jié)損壞的程度。這些骨折可以復(fù)制由高能量沖擊(例如機(jī)動車事故)造成的人體損傷。關(guān)節(jié)內(nèi)脛骨平臺骨折也可以跟蹤OA 中炎癥的早期影響[44]，也是研究急性損傷后關(guān)節(jié)退變中發(fā)生致病性變化的理想模型。②關(guān)節(jié)軟骨脛骨循環(huán)壓縮，在該模型中，向膝關(guān)節(jié)施加軸向載荷，導(dǎo)致脛骨相對于股骨的前移[45]。通過在一段時間內(nèi)多次循環(huán)并調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)上的載荷可以研究長期損傷對關(guān)節(jié)的影響。而通過短時間內(nèi)重復(fù)負(fù)載可用于研究軟骨下骨的變化。但該模型中對側(cè)肢體不能用作同側(cè)肢體所承受負(fù)荷的對照[46]。該模型中可見膝關(guān)節(jié)骨贅加速增加，負(fù)荷較高時可見更快速的軟骨退變[47]。關(guān)節(jié)軟骨脛骨循環(huán)壓縮模型是研究慢性損傷對發(fā)育影響的首選模型。③關(guān)節(jié)過載，與關(guān)節(jié)軟骨循環(huán)壓縮模型一樣，關(guān)節(jié)過載模型依賴于類似脛骨前半脫位機(jī)制產(chǎn)生損傷。前者存在的問題是需要長時間多個循環(huán)來誘導(dǎo)OA 的嚴(yán)重癥狀。這種脛骨壓縮過載導(dǎo)致交叉韌帶的中間物質(zhì)破裂。由于周期性脛骨壓迫引起的交叉韌帶撕裂與人類交叉韌帶損傷病理相似。如果負(fù)荷和速度足夠強(qiáng)，交叉韌帶會從中間部位撕裂，如果負(fù)荷或速度較低則從脛骨平臺下方撕裂[48]。該模型非常適合研究早期OA 的變化以及急性低能量影響后早期治療的效果(如膝關(guān)節(jié)運(yùn)動損傷)[49-50]。

3.2.2 關(guān)節(jié)內(nèi)沖擊模型 關(guān)節(jié)內(nèi)沖擊模型主要應(yīng)用在犬和兔類。造模的裝置都是落塔裝置，該裝置可以敲擊髕骨，并對髕骨造成損害，使動物關(guān)節(jié)呈現(xiàn)髕骨性關(guān)節(jié)炎的病理特征。

①犬類模型。目前已開發(fā)多種非侵入性犬模型用于OA 各個方面的研究[51]。犬科動物模型中使用了拉布拉多犬、金毛獵犬和德國牧羊犬等多種品種，而比格犬是非侵入性模型犬類中最常用的動物。利用落塔裝置撞擊髕骨可用于模擬因關(guān)節(jié)撞擊后關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)的OA 早期病理變化[52]。且此法可以產(chǎn)生較高的軟骨病變[53]。有研究[54]表明，犬類模型可以使用自體骨移植，并在12 個月時明顯改善關(guān)節(jié)癥狀。對OA 犬類使用富血小板血漿治療改善跛行癥狀[55]。犬類模型還提供了一種新的可能，即利用MRI 及mCT 影像結(jié)果取代組織病理學(xué)來對OA 發(fā)病程度進(jìn)行測量[56]。

②兔類模型。類似于犬類模型，兔類模型也是通過關(guān)節(jié)內(nèi)沖擊對兔的髕骨造成機(jī)械性損傷。亞骨折是導(dǎo)致兔膝蓋OA 變化的原因之一，有的兔模型則利用過量運(yùn)動來誘導(dǎo)骨重塑[57-58]，此外還有大量利用擺錘撞擊股骨髁導(dǎo)致膝外傷的模型[59]。然而，撞擊股骨髁模型和兔關(guān)節(jié)拉伸后沖擊模型在進(jìn)行造模過程中或多或少會采取手術(shù)方式，此舉會帶來一些不利影響，在前文中有所提及。

4 總結(jié)

OA 實(shí)驗(yàn)動物模型種類繁多，造模方式各異，不同的造模方式有不同的適應(yīng)范圍，但其基本原理大都為模擬人體OA 發(fā)病過程中的生物力學(xué)改變、局部軟組織生理病理改變、整體激素水平改變等。大型動物關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較人體結(jié)構(gòu)更為相似，但由于飼養(yǎng)成本高、倫理審批難以通過等原因在普通的實(shí)驗(yàn)研究中難以使用；而小動物雖容易飼養(yǎng)但關(guān)節(jié)腔的體積非常小，很難利用影像學(xué)進(jìn)行分析。各種動物不同模型各有利弊。綜上所述，合理地選擇實(shí)驗(yàn)動物和造模方式可以使我們在動物模型上更好地模擬人類OA 的發(fā)病機(jī)制和過程, 更全面地闡釋中醫(yī)藥治療OA 的藥效機(jī)制。