殼聚糖復(fù)合止血海綿的制備及其在硅膠球囊中的應(yīng)用

湯瑞明 耿在云 宋亮 王超

【摘 要】當(dāng)前，越來越多的女性推遲了結(jié)婚與生育，大齡產(chǎn)婦明顯增多，產(chǎn)后出血已成為婦女生育后常見的一種現(xiàn)象。宮腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的嚴(yán)重產(chǎn)后出血，因此研究開發(fā)新型宮內(nèi)止血球囊器械具有重要意義。為進(jìn)一步提高止血球囊的止血效果，文章就研究開發(fā)的硅膠止血球囊表面包覆殼聚糖止血海綿的止血性質(zhì)進(jìn)行一系列探討，具體包括止血海綿的制備、微觀結(jié)構(gòu)分析、吸水率測(cè)定、凝血性能測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)試等，研究結(jié)果表明，文章制備的殼聚糖/海藻酸鹽復(fù)合止血海綿具有良好的止血效果，可用于新型止血球囊表面包覆。

【關(guān)鍵詞】殼聚糖;海藻酸鹽;白芨;海綿;止血

0 引言

隨著我國全面二孩政策的實(shí)施，大齡產(chǎn)婦明顯增多，產(chǎn)后出血已成為婦女生育后常見的一種現(xiàn)象[1]。目前，如何降低產(chǎn)后出血量，已經(jīng)成為廣大醫(yī)生與醫(yī)療器械生產(chǎn)制造企業(yè)不懈的共同追求目標(biāo)。治療產(chǎn)后出血的方法包括藥物保守治療、盆腔血管結(jié)扎法、改良式B-Lynch子宮背帶式縫合、血管性介入治療和物理子宮填塞壓迫止血等[2-3]。其中，宮腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的嚴(yán)重產(chǎn)后出血[4-5]。由于該止血方法具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)孕產(chǎn)婦危害小、費(fèi)用低、安全快速、術(shù)后康復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，因此研究開發(fā)新型宮內(nèi)止血球囊器械具有重要意義。為進(jìn)一步提高止血球囊的止血效果，本文就江蘇瑞京科技發(fā)展有限公司研究開發(fā)的硅膠止血球囊表面包覆殼聚糖止血海綿的止血性質(zhì)進(jìn)行一系列探討，為開發(fā)具有更好的止血球囊創(chuàng)造條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料試劑

殼聚糖（簡(jiǎn)稱CS），中等黏度，購自阿拉丁試劑公司;海藻酸鈣（簡(jiǎn)稱Alg-Ca）：自己制作多孔微球;白芨多糖（簡(jiǎn)稱BSP）：實(shí)驗(yàn)室自己提取;戊巴比妥鈉（P3790），購自SECOMA公司;戊二醛25%，購自科密歐化學(xué)試劑公司;胎牛血清，Procell公司;DMEM培養(yǎng)液，購自Procell公司;小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3，購自Procell公司。

1.1.2 主要儀器

冷凍干燥機(jī)，型號(hào)為LGJ-10C，由四環(huán)科學(xué)儀器公司制造;冷凍離心機(jī)，由日本日立公司制造;S-4800型掃描電子顯微鏡，由日本日立公司制造;生物數(shù)碼顯微鏡，型號(hào)為MC-1180，由蔚儀金相試驗(yàn)儀器公司制造;iMark酶標(biāo)儀，由Bio-RAD公司制造。

1.2 復(fù)合海綿的制備

稱取一定量殼聚糖加到100 mL 1%醋酸溶液中，靜置脫泡，獲得殼聚糖醋酸溶液。

稱取一定量海藻酸鈣，按5%、10%、15%、20%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加入到以上的殼聚糖溶液中，攪拌均勻，即得到CS/Alg-Ca混合溶液。

稱取一定量白芨多糖，按2.5%、5%、7.5%、10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加入到以上的上述殼聚糖/海藻酸鈣溶液中，攪拌均勻，即得到CS/Alg-Ca/Bsp溶液。

CS/Alg-Ca復(fù)合海綿制備：準(zhǔn)確稱取一定量殼聚糖溶液，加入5%、10%、15%、20%的Alg-Ca海藻酸鈣微球，于-70 ℃溫度下冷凍干燥，得到CS/Alg-Ca復(fù)合海綿。

1.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

按照掃描電子顯微鏡的制樣方法制作樣品，然后在合適的放大倍數(shù)下觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 復(fù)合海綿吸水率測(cè)定

將復(fù)合海綿裁成長方條，干燥至恒重，稱重標(biāo)記為W0。樣條放入含生理鹽水燒杯中，浸泡3 min，瀝水1 min，吸掉表面的水分，稱重標(biāo)記為Wt。吸水率按如下公式計(jì)算：吸水率=Wt-W0/W0×100%

1.5 復(fù)合海綿的凝血測(cè)試

根據(jù)Shih MF方法，用全血凝血指數(shù)BCI進(jìn)行評(píng)根據(jù)Shih MF方法，用全血凝血指數(shù)BCI進(jìn)行評(píng)價(jià)。用紫外分光光度計(jì)在波長545 nm處測(cè)其吸光度。BCI計(jì)算方法如下：

BCI=A樣品/A空白×100%

1.6 復(fù)合海綿對(duì)凝血酶原時(shí)間（PT）的影響

取各種復(fù)合海綿與殼聚糖海綿，在紫外燈下滅菌，然后測(cè)定PT。

在37 ℃恒溫水浴中，待測(cè)樣品孵育3 min，加入0.1 mL血漿，吸收后，加入0.2 mL的37 ℃預(yù)溫PT試劑，開始計(jì)時(shí)，到出現(xiàn)絲狀物即停止計(jì)時(shí)，記錄成絲時(shí)間，即為PT。

1.7 溶血率測(cè)定

材料的溶血率根據(jù)GB/T 14233.2—2005的要求進(jìn)行測(cè)試。計(jì)算公式如下：

溶血率=（B樣品-B陰性）/（B陽性-B陰性）×100%

1.8 細(xì)胞毒性的測(cè)定

采用CCK-8法，測(cè)試復(fù)合海綿對(duì)3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性。根據(jù)GB/T 16886.5—2003的規(guī)定，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）：

RGR=OD（實(shí)驗(yàn)組）/OD（對(duì)照組）×100%

1.9 動(dòng)物止血評(píng)價(jià)

本文采用動(dòng)脈血管為出血模型。將大鼠剝離出股動(dòng)脈，施以準(zhǔn)備好的待測(cè)樣品，開始計(jì)時(shí)，直至完全止血，記錄止血時(shí)間，然后稱量止血后的紗布和材料的總重后計(jì)算出血量。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖海綿的微觀結(jié)構(gòu)分析

圖1為殼聚糖和CS/Alg-Ca復(fù)合海綿的SEM和生物顯微鏡圖。A1～E1為SEM圖，A2～E2為放大40倍觀察到的圖。

其中，A1、A2為純殼聚糖;B1、B2為CS/Alg-Ca5;C1、C2為CS/Alg-Ca10;D1、D2為CS/Alg-Ca15;E1、E2為CS/Alg-Ca20;F為純殼聚糖;G為復(fù)合海綿。

從圖1可以看到，所得海綿具有蜂窩狀的多孔結(jié)構(gòu)且相互連通，主要結(jié)構(gòu)顯示為片狀結(jié)構(gòu)，如果加入多孔微球，海綿結(jié)構(gòu)沒有受到太大影響，微球主要黏附在片層上。隨著微球量的增加，位于海綿表面和內(nèi)部的微球數(shù)量也增多，出現(xiàn)了團(tuán)聚現(xiàn)象。這是因?yàn)闅ぞ厶鞘菐д娦缘亩嗵?，微球則帶負(fù)電荷，通過電荷作用，導(dǎo)致微球出現(xiàn)團(tuán)聚，從而影響分散。

2.2 殼聚糖海綿的吸水率變化

圖2為復(fù)合海綿吸水率隨著Alg-Ca微球含量變化產(chǎn)生的曲線。曲線顯示，隨著微球含量的增加，海綿材料的吸水率出現(xiàn)先增加后減小的趨向。這是因?yàn)榧尤胛⑶蚱鸬搅朔肿雍Y的效果，提高了整體吸水性;同時(shí)，微球也增加了海綿中親水成分。數(shù)據(jù)顯示，海藻酸鈣含量為10%的復(fù)合海綿最大吸水率可以達(dá)到4 295.06%。

2.3 殼聚糖海綿的體外凝血分析

從圖3可以看出，制備的殼聚糖/海藻酸鈣復(fù)合海綿的凝血指數(shù)較小，并且逐漸隨著微球含量增加而減小。純殼聚糖的凝血指數(shù)是63.15%，CS/Alg-Ca5的凝血指數(shù)是47.80%，CS/Alg-Ca10的凝血指數(shù)是42.05%，CS/Alg-Ca15的凝血指數(shù)是33.09%，CS/Alg-Ca20的凝血指數(shù)是30.39%。CS/Alg-Ca/Bsp10的凝血指數(shù)最小為22.41%。分析認(rèn)為，微球可以不斷放出鈣離子，能夠激活凝血因子。白芨多糖能夠有效縮短凝血酶原時(shí)間，促進(jìn)血小板的凝集。所以，三元復(fù)合海綿的凝血效果比二元復(fù)合海綿的凝血效果更好。

2.4 組成不同的海綿對(duì)PT的影響

表1為不同組成比例對(duì)PT的影響效果，純殼聚糖差別不大，表明殼聚糖凝血不同于海藻酸鈣凝血。由于海藻酸鈣微球釋放出的Ca2+作用的結(jié)果，CS/Alg-Ca10復(fù)合海綿對(duì)PT影響較小，而含白芨多糖的三元海綿對(duì)PT影響顯著，并且隨多糖量的增加，PT值呈現(xiàn)較少趨勢(shì)。因此可以證明，CS/Alg-Ca/Bsp三元復(fù)合海綿可以有效提高凝血速率。

2.5 殼聚糖海綿的溶血率

表2為檢測(cè)材料與新鮮抗凝血作用后紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白量。除了純殼聚糖，其他所有的復(fù)合海綿的溶血率均能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的溶血率小于5%的數(shù)值，符合醫(yī)療器械中生物材料對(duì)溶血的要求。

2.6 海綿材料細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果

采用CCK-8方法測(cè)試的復(fù)合海綿對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3的相對(duì)增殖率如圖4所示，可以看出，各組成比例下，細(xì)胞相對(duì)增殖率都超過90%，之間無明顯差異。加入白芨多糖，細(xì)胞相對(duì)增殖率則都超過100%，表明海綿材料的細(xì)胞毒性為零級(jí)，均有利于細(xì)胞的生長，對(duì)創(chuàng)傷的愈合起到促進(jìn)作用。

2.7 殼聚糖海綿的動(dòng)物出血模型止血效果

圖5為SD鼠股動(dòng)脈出血模型，表3為不同復(fù)合海綿的止血測(cè)試結(jié)果，數(shù)據(jù)顯示，三元復(fù)合海綿的止血效果最好，其次是二元復(fù)合海綿，最后是純殼聚糖與明膠制作海綿。更進(jìn)一步看出，白芨含量為10%的三元復(fù)合海綿的止血效果最佳，出血量最少，其與純殼聚糖相比，止血效率提升了47.3%，與CS/Alg-Ca10海綿相比，也提升了39.3%，比明膠海綿也提升了41.7%。這充分表明，殼聚糖、海藻酸鈣微球和白芨多糖產(chǎn)生了協(xié)同作用，能夠更有效止血。

2.8 止血機(jī)理分析

殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，在生物醫(yī)用敷料、藥物載體等領(lǐng)域獲得較多應(yīng)用。從他人文獻(xiàn)可以看到，殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)中的第二個(gè)碳上帶有氨基，在酸性條件可以接受一個(gè)質(zhì)子，成為帶正電荷的銨離子，而紅細(xì)胞是帶負(fù)電荷的，通過電荷作用，能夠使紅細(xì)胞聚集在創(chuàng)口，可以激活凝血系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)止血[6-9]。海藻酸鹽最大可吸收自身重量的20倍水分，海藻酸鈣多孔微球則是通過放出其所含的鈣離子，與凝血系統(tǒng)分?jǐn)?shù)作用，刺激形成纖維蛋白原，從而吸附紅細(xì)胞，達(dá)到止血效果[10-12]。白芨多糖是依靠其能夠促進(jìn)血小板凝集，并且縮短凝血酶原時(shí)間，從而達(dá)到凝血作用。因此，本文通過將海藻酸鈣多孔微球、白芨多糖、殼聚糖復(fù)合，獲得一種新型的海綿材料，通過提高材料吸水性能，同時(shí)提升了材料的止血性能，可作為新型止血材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

3 結(jié)論

通過對(duì)復(fù)合海綿的理化性能、生物學(xué)性能和止血性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出如下結(jié)論。

（1）復(fù)合海綿中摻入白芨多糖，能夠有效縮短凝血酶原時(shí)間，提高止血速度，容易實(shí)現(xiàn)快速地止血。

（2）凝血指數(shù)BCI值結(jié)果表明，微球含量和白芨多糖含量高的復(fù)合海綿的凝血效果較佳，動(dòng)物止血實(shí)驗(yàn)表明，白芨多糖含量越高，復(fù)合海綿止血時(shí)間越短，出血量越少。

（3）通過溶血率、全身急性毒性實(shí)驗(yàn)等分析，本研究制備的三元復(fù)合海綿具有良好的生物相容性。

參 考 文 獻(xiàn)

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