徐 冬,余 健 ,陳 勇,薛 翠,宋玲英,陳 琳,孔天翔
機械通氣是臨床上為患者提供呼吸支持的常用重要治療手段,可以維持氣道通暢,但其使用不當時出現的氣壓傷、容積傷、切應力傷及生物性損傷等均會引起肺組織損傷,造成呼吸機相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)[1]。研究顯示[2],VILI損傷與肺血管內皮細胞的結構和功能改變密切相關,內皮功能受損后,可引起肺動脈高壓、微循環(huán)障礙、動脈粥樣硬化等多種病理生理變化。核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路是細胞內調節(jié)炎性因子的最重要細胞因子,參與調節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)等多種炎性因子的表達,在VILI損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3]。近年來的研究顯示,Rac 1抑制劑可以抑制經由Akt介導的NF-κB信號通路,調節(jié)細胞內炎癥反應,保護VILI大鼠肺組織損傷[4],但其對肺血管內皮細胞的作用尚不清楚。因此,本研究基于Akt/NF-κB信號通路探討了Rac 1抑制劑NSC23766預先處理對VILI大鼠內皮功能的保護作用及機制,旨在為VILI的治療提供一定的理論基礎。
1.1試劑與儀器 7500 RT-PCR系統購自于美國Applied Biosystems;電子天平(型號AUW220D,感量0.1 g)購自日本島津公司;小動物呼吸機(HX-101E)購自成都泰萌有限公司;IL-1β、IL-10和TNF-α試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司;內皮素-1(ET-1)檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司;誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)引物由上海生工生物工程有限公司合成;辣根過氧化酶(HRP)標記兔抗鼠IgG,購自北京中杉金橋生物技術公司;β-actin鼠單克隆抗體、兔抗人單克隆抗體絲/蘇氨酸激酶(Akt)、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65,均購自美國Abcam公司。
1.2實驗動物 選取SPF級SD雄性大鼠36只,體重均為200~220 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK(京)2015-0001,飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室,保持室溫恒定為25℃,模擬晝夜光照,自由攝食與飲水。
1.3動物造模及給藥方法 大鼠預飼養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、模型組和NSC23766組,每組12只。模型組和NSC23766組大鼠采用大潮氣量法復制VILI模型[5], 2%戊巴比妥鈉溶液2 ml/kg腹腔注射進行麻醉,常規(guī)消毒皮膚,于大鼠頸部正中做一切口,暴露氣管,行氣管插管術,連接至小動物呼吸機,設置呼吸機參數:呼氣末正壓為0,呼吸頻率為40/min,氧氣濃度為21%,呼吸比為1∶1,潮氣量為40 ml/kg。對照組只行氣管切開,保留自主呼吸。大鼠在連接呼吸機前,NSC23766組經氣管導管滴入NSC23766(1.5 mg/kg)預處理1 h,模型組和對照組經氣管導管滴入等體積生理鹽水預處理1 h。機械通氣4 h后處死大鼠,結扎左肺門,用預冷PBS反復灌洗右側肺泡,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),收集血液、BALF和左肺組織備用。
1.4大鼠肺組織病理學 取各組大鼠左肺下葉組織,濾紙吸干表面水分,采用電子天平稱取濕重后,置入75℃恒溫烤箱中烘烤3 d至恒重,稱取干重,計算濕重/干重(W/D)值。取大鼠左肺中葉組織,采用4%多聚甲醛固定,進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片,進行蘇木精/伊紅(HE)染色,于光鏡下觀察肺組織的病理變化,每張切片隨機取5個視野拍照。
1.5大鼠BALF中相關指標檢測 取各組大鼠BALF,離心(2000 r/min,10 min),采用酶聯免疫吸附法檢測IL-1β、IL-10、TNF-α水平,嚴格按試劑盒說明書進行測定;采用考馬斯亮藍染色法檢測BALF中總蛋白水平;采用細胞計數法檢測BALF中白細胞(WBC)數量。
1.6大鼠肺組織中NO和ET-1的檢測 取各組大鼠肺組織0.1 g,加入0.1 ml生理鹽水,勻漿,離心(3000 r/min,10 min),取上清,采用硝酸還原酶法測定NO水平,放射免疫直接測定法檢測ET-1水平,嚴格按試劑盒說明書進行測定。
1.7大鼠肺組織中iNOS和eNOS mRNA表達水平 采用熒光定量PCR(RT-PCR)檢測iNOS和eNOS mRNA水平,取肺組織0.1 g,加入0.1 ml生理鹽水,勻漿,采用Trizol裂解液提取總RNA,經紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度,經反轉錄試劑盒合成cDNA,進行RT-PCR反應,iNOS上游引物:5'-TAGAGGAACATCTGGCCAGG-3',下游引物:5'-TGGCCGACCTGATGTTGCCA-3';eNOS上游引物:5'-ATCCTGGCAGCCCTAAGACC-3',下游引物:5'-TGGTAGCGTTGCTGATCCCG-3',以GAPDH為內參,計算各組iNOS和eNOS mRNA的相對表達量。
1.8Akt/NF-κB信號通路的表達 采用Western Blot法檢測,取肺組織,勻漿,采用細胞裂解液直接提取總蛋白檢測Akt和NF-κB p65的磷酸化水平,采用BCA法進行蛋白定量,取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉膜至PVDF膜,室溫密封2 h,采用TBST洗膜并加一抗Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65(稀釋比例均為1∶500),于4℃孵育過夜,TBST洗膜加HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶1000),于室溫下孵育2 h。再用ECL化學發(fā)光顯示,收集影像,用凝膠圖像處理系統分析對比條帶強弱,選用β-actin作為內參。
2.13組大鼠肺組織的病理變化 對照組大鼠肺組織細胞結構完整,未見明顯病理變化。模型組大鼠肺組織可見肺泡結構紊亂,肺泡腔融合變大,伴大量炎性細胞浸潤。NSC23766組大鼠的肺組織病理損傷較模型組大鼠明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少。見圖1。對照組、模型組和NSC23766組大鼠肺組織的W/D值分別為4.21±0.41、5.46±0.52、4.72±0.43。與對照組比較,模型組大鼠肺組織W/D值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,NSC23766組大鼠肺組織W/D值顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05)。
圖1 3組大鼠肺組織的病理變化(HE×200)
2.23組大鼠BALF中總蛋白和WBC比較 與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠BALF中總蛋白和WBC數值顯著增高,且模型組高于NSC23766組(P<0.05)。見表1。
表1 3組大鼠BALF中總蛋白和WBC比較
注:BALF為支氣管肺泡灌洗液,WBC為白細胞;與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,cP<0.05
2.33組大鼠BALF中炎性因子比較 與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,且模型組高于NSC23766組(P<0.01)。見表2。
表2 3組大鼠BALF中炎性因子比較
注:BALF為支氣管肺泡灌洗液,IL-1β為白介素-1β,IL-6為白介素-6,TNF-α為腫瘤壞死因子-α;與對照組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01
2.43組大鼠肺組織NO和ET-1水平比較 與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠肺組織中NO和ET-1水平顯著升高,且模型組高于NSC23766組(P<0.05)。見表3。
2.53組大鼠肺組織iNOS和eNOS mRNA表達水平比較 與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠肺組織中iNOS mRNA表達水平升高,且NSC23766組低于模型組(P<0.01)。與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠肺組織eNOS mRNA表達水平下降,且NSC23766組高于模型組(P<0.01)。見表4。
表3 3組大鼠肺組織NO和ET-1表達水平比較
注:NO為一氧化氮,ET-1為內皮素-1;與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,cP<0.05
表4 3組大鼠肺組織iNOS和eNOS mRNA水平比較
注:iNOS為誘導型一氧化氮合酶,eNOS內皮型一氧化氮合酶;與對照組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01
2.63組大鼠肺組織Akt/NF-κB表達水平比較 與對照組相比,模型組和NSC23766組大鼠肺組織中p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平明顯升高,且模型組高于NSC23766組(P<0.01)。見圖2和表5。
圖2 3組大鼠肺組織Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平
表5 3組大鼠肺組織p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達水平比較
注:與對照組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01
VILI是機械通氣的嚴重并發(fā)癥,主要表現為肺血管內皮細胞損傷、血管通透性增加、肺水腫等,臨床尚無治療的特效藥物[6];研究VILI發(fā)生發(fā)展的機制,對其治療和預防具有重要意義。文獻報道示,Rac 1抑制劑NSC23766可調節(jié)機體重要的NF-κB炎癥信號通路,保護腎組織細胞損傷[7],但對VILI內皮功能的影響報道較少。目前臨床常用較大潮氣量、較高通氣壓力、破壞肺表面活性物質等方法來復制VILI動物模型,其中較大潮氣量法較常用且操作簡單[8]。故本研究采用較大潮氣量法復制大鼠VILI模型,分析NSC23766預處理對VILI大鼠血管內皮功能的影響。W/D值可反映肺組織的含水量變化,臨床常用其反映肺水腫嚴重程度[9],本研究結果顯示,NSC23766組大鼠肺組織W/D值低于模型組,提示NSC23766預處理可減輕VILI大鼠肺組織水腫,保護肺組織。BALF中總蛋白和WBC數值反映了肺組織毛細血管的通透性變化和肺組織的炎性因子水平[10],IL-1β、IL-6和TNF-α均為活化的單核/巨噬細胞合成并分泌的致炎因子,可誘導多種炎性介質產生,參與肺組織損傷后的細胞水腫、炎癥反應、細胞凋亡等病理過程,加重肺組織損傷[11-12]。本研究結果顯示,NSC23766組大鼠BALF中總蛋白、WBC數值、IL-1β、IL-6和TNF-α低于模型組。提示NSC23766預處理可以降低毛細血管通透性并抑制炎性因子釋放,保護肺組織,減輕肺損傷。
本研究結果顯示,NSC23766組eNOSmRNA高于模型組,NO、EF-1、iNOSmRNA低于模型組,提示NSC23766預處理干預可以促進肺組織eNOS的表達,抑制iNOS的表達,降低VILI大鼠肺組織ET-1和NO水平,且隨著濃度升高,其作用逐漸增強。iNOS和eNOS是合成NO的關鍵限速酶,其中eNOS合成的低濃度NO可以抑制ET-1的分泌,發(fā)揮其擴血管、抑制血管平滑肌增殖的生物效應,而在炎性因子等刺激下活化的iNOS可產生大量的NO,過量的NO具有細胞毒性作用,可以誘導血管內皮細胞損傷[13]。ET-1和NO是由血管內皮細胞分泌的調節(jié)血管舒縮的細胞因子,ET-1可以促進血管平滑肌增殖,誘導血管內皮細胞損傷[14]。左艇等[15]報道,NO和ET-1水平變化與肺血管內皮細胞損傷密切相關,提示NSC2766預處理可能通過調節(jié)肺組織iNOS和eNOS的表達,降低肺組織NO和ET-1水平,調節(jié)血管的舒縮作用,保護肺血管內皮細胞功能。
本研究結果顯示,NSC23766組p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達低于模型組,提示NSC23766預處理可降低VILI大鼠肺組織Akt和NF-κB的磷酸化。NFκB信號通路是細胞內最重要的調控炎性因子的信號通路,在VILI發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。文獻報道,在生理狀況下NF-кB與IκB結合處于被抑制狀態(tài),一旦發(fā)生磷酸化被激活,可釋放NF-κB/p65進入胞核與靶序列結合,促進下游TNF-α等炎性細胞因子的表達,加重組織損傷[16]。Lu 等[17]報道,NSC23766可以抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信號通路,參與調節(jié)機體的炎癥反應,提示NSC23766可能通過抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信號通路,降低VILI大鼠的炎癥反應。Sara等[18]報道,甘草查爾酮C可以抑制NF-κB/iNOS/NO信號通路,保護脂多糖誘導H9c2細胞損傷,提示NSC23766預處理可能通過抑制Akt/NF-κB信號通路,調節(jié)iNOS和eNOS的表達,降低炎性因子水平,保護肺血管內皮細胞功能,減輕肺組織損傷。
綜上所述,NSC23766預處理可能通過抑制VILI大鼠Akt/NF-κB信號通路,調節(jié)其肺組織中iNOS和eNOS的表達,降低肺組織炎性因子、NO和ET-1水平,保護肺血管內皮細胞結構和功能,減輕肺組織損傷,有望應用于臨床VILI的預防和治療。