厚味γ-Glu-Ile肽的谷氨酰胺酶酶法合成

梁天一，曾曉房，董浩，白衛(wèi)東，楊娟*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣州 510225；2.哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，哈爾濱 150028)

厚味(thick taste)指的是食物中的厚味物質(zhì)和基本的味道物質(zhì)之間的相互作用，使食物中鹽的味道、鮮味和甜味等基本的味覺感受更加明顯，并且使食物本身具有厚實、持久、飽滿、鮮明的綜合味道，常用mouthfulness，long-lastingness，complexity等表達[1]。目前為止，能引起食物厚味風味的這類γ-谷氨酰肽主要有γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met等[2]。研究表明，γ-谷氨酰肽的合成通常是γ-谷氨酰二肽的配位，并且是最常見的酶進入方法。 與γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT，EC 2.3.2.2)和谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)顯著相關(guān)[3-7]。GGT酶和谷氨酰胺酶用于合成γ-谷氨酰肽的最佳轉(zhuǎn)肽溫度均為37 ℃，最佳pH值在9～10.5之間，以谷氨酰胺為γ-谷氨酰的供體，氨基酸作為γ-谷氨酰的受體，其中苦味氨基酸通過催化轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰化形式后，其苦味消失、厚味生成。幾乎所有的GGT酶均可以用于合成γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Val、γ-Glu-Leu和γ-Glu-Glu等已被成功合成。只有部分谷氨酰胺酶的微生物來源可用于捕獲γ-谷氨酰肽合成，如米曲霉源谷氨酰胺酶、硝基還原假單胞源谷氨酰胺酶和解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶等，包括γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Gly等γ-谷氨酰二肽的合成。幾乎所有苦味氨基酸均通過GGT酶或者谷氨酰胺酶催化轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰二肽，而尚未見異亮氨酸通過γ-谷氨?；铣搔?Glu-Ile的反應(yīng)。所以，本研究試圖用一株商用的解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶進一步催化異亮氨酸轉(zhuǎn)化為厚味γ-Glu-Ile。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

谷氨酰胺酶：日本天野酶制品株式會社；纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸：購于精科試劑公司；γ-Glu-Ile：購于上海雅心生物技術(shù)有限公司；乙腈、純甲醇：購于天津市百世化工有限公司；商用的雞肉湯粉、各種調(diào)味品、感官標準品(食品級)：購于佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SHZ-88水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市國旺儀器廠；MF1204C型電子天平 上海歐萊博實驗室器材供應(yīng)商；PHS-3E pH計 杭州美尼特儀器自動化儀表有限公司；LGJ-12立式真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術(shù)股份有限公司；AVANCE III HD 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國Bruker 公司；島津LC 20-A型高效液相色譜儀 杭州瑞析科技有限公司；Biochrom 30+ 全自動氨基酸分析儀 大昌洋行(上海)有限公司；島津LC10ATVP高效液相色譜儀 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶酶法合成γ-Glu-Ile

考慮將GGT酶作為合成γ-谷氨酰肽底物參數(shù)的催化劑：將200 mmol/L谷氨酰胺(供體氨基酸)與100 mmol/L異亮氨酸混合，調(diào)節(jié)pH至10.0，加入0.05 U/mL谷氨酰胺酶作為反應(yīng)的起始點。 反應(yīng)在友聯(lián) HH-4恒溫水浴中于37 ℃進行4 h，然后將酶用沸水浴在100 ℃下懸浮20 min滅活。采用LGJ-12立式真空冷凍干燥機對反應(yīng)液進行冷凍干燥，備用。酶法合成γ-Glu-Ile的方法優(yōu)化：變化底物濃度比、pH值和溫度等條件，獲得最佳的γ-Glu-Ile酶促反應(yīng)條件。

1.2.2 酶促反應(yīng)液中氨基酸含量的測定

使用Biochrom 30+自動氨基酸分析儀測定每種酶促反應(yīng)溶液中游離氨基酸的含量。 將適當?shù)臉悠敷w積溶解在超純水中，攪拌并均勻混合，使氨基酸在室溫下靜置30 min，然后置于50 mL容量瓶中; 定容后取4 mL樣品，取樣品∶磺基水楊酸(15%)為 4∶1加入磺基水楊酸，混合均勻，并在4 ℃冷藏60 min；將溶液在4 ℃下以1000 r/min離心15 min，然后將上清液進行再次離心，將上清液通過0.22 μm過濾器過濾并在氨基酸分析儀上檢測。

1.2.3 HPLC法定性定量檢測產(chǎn)物

參考Suzuki等人的方法，采用島津LC10ATVP高效液相色譜儀對可在每個反應(yīng)中合成的γ-谷氨酰肽進行進一步實驗。通過XSelect HSS T3 柱(5 μm， 4.6 mm×250 mm，Waters，USA)分離γ-谷氨酰肽。標準方法是0.1%甲酸-乙腈(A)和0.1%甲酸-水溶液(B)。洗脫梯度，操作參數(shù)為90% B+10% A，然后以85% B+15% A，再次洗脫5 min，如果20% B+80% A，在5 min之后，回到90% B+10% A并將此等級設(shè)定為25 min；日立L-7100紫外掃描儀(Hitachi，Tokyo，Japan)用于檢測。在220 nm處，將柱溫設(shè)定為40 ℃以將進樣量體積增加至10 μL。擴增的γ-谷氨酰肽片段，使用LGJ-12冷凍干燥反應(yīng)序列以檢測同一性。

1.2.4 NMR鑒定γ-Glu-Ile結(jié)構(gòu)

參考Suzuki等人的方法，采用布魯克AVANCE III HD 600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀對γ-谷氨酰肽進行進一步的結(jié)構(gòu)鑒定。將5 mg凍干樣(高效液相色譜分離后餾分中的目標γ-谷氨酰肽)溶入適量的重水里，之后送入超導(dǎo)核磁共振波譜儀進行氫譜鑒定。利用MestReNova 9.0 Reader 核磁共振分析專用軟件對圖譜進行分析。

1.2.5 γ-Glu-Ile改善和增強常見食品的呈味效果

將一定濃度的γ-Glu-Ile溶液分別添加到適度稀釋的商用雞湯、牛肉湯或者醬油中。通過五分評分制評價γ-Glu-Ile對這3種食物的鮮味、厚味、酸味和甜味的增加效果。在專業(yè)敏感評估小組中，選出了15名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評估人員(8男7女，年齡在23～35歲之間，其中7人的感官評估經(jīng)驗超過2年)。對于味道評估，感官評估室的溫度固定在(23±2) ℃。每個評估員品嘗10 mL的樣品，將樣品放入口中25 s，然后慢慢吞咽。評估樣品后，評估員應(yīng)用純水沖洗口腔，然后品嘗下一個樣品，記錄每個樣品的原始味道分數(shù)。

采用滋味稀釋分析法和三選一實驗(three-alternative forced-choice)對γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值進行評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-Glu-Ile的定性定量檢測

采用島津LC 20-A型高效液相色譜儀對反應(yīng)液進行分離鑒定，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)混合物的HPLC色譜圖，插入目標產(chǎn)物的NMR光譜Fig.1 HPLC chromatogram of the reaction mixture, inserted NMR spectrum of the target product

注：在pH 7.5和37 ℃的條件下用100 mmol/L Ile，200 mmol/L Gln和0.05 U/mL谷氨酰胺酶進行反應(yīng)。

由圖1可知，酶促反應(yīng)液中目標組分均在10 min內(nèi)得到良好分離。其中，目標產(chǎn)物γ-Glu-Ile的出峰時間為7.550 min，分辨率均大于2.0，分離度大于99.7%。由結(jié)果得出解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶可以催化γ-谷氨酰二肽的合成，與米曲霉源谷氨酰胺酶催化γ-谷氨酰二肽合成的轉(zhuǎn)化率接近。通過外標法對各產(chǎn)物進行了定量分析，各個標準品的回收率在96%～105%之間，精密度測定的結(jié)果顯示低于1%，說明此方法可用于γ-谷氨酰二肽的定量分析。

圖2 谷氨酰胺酶催化的γ-Glu-Ile合成Fig.2 The synthesis of γ-Gln-Ile catalyzed by glutaminase

注：將含有200 mmol/L Gln和100 mmol/L Ile(pH 10.0)和谷氨酰胺酶(0.05 U/mL)的反應(yīng)混合物在37 ℃下孵育12 h。 通過HPLC測定反應(yīng)混合物中γ-Glu-Ile和Ile的量隨時間的變化。

由圖2可知，在反應(yīng)的前10 h內(nèi)，γ-Glu-Ile的產(chǎn)量隨著反應(yīng)時間的延長而不斷增加，而后隨著反應(yīng)時間延長，產(chǎn)率基本不變，最大產(chǎn)量為10.79 mmol/L。底物(異亮氨酸)的含量隨著反應(yīng)時間延長而減少，到反應(yīng)結(jié)束，異亮氨酸殘余量為49.43 mmol/L。底物殘余量與產(chǎn)物產(chǎn)量間存在極大差異，暗示有副產(chǎn)物的產(chǎn)生。GGT酶在催化γ-谷氨酰二肽合成的過程中，類似γ-Glu-γ-Glu-Tau或聚谷氨酸等物質(zhì)通常被定義為副產(chǎn)物檢出[8]。谷氨酰胺酶在催化底物氨基酸轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰二肽的過程中也有γ-[Glu]n-AA的產(chǎn)生[9]。

對目標產(chǎn)物(γ-Glu-Ile)凍干樣進行超導(dǎo)核磁共振波譜儀分析，結(jié)果見圖1。(1H NMR (600 MHz, D2O) )：δ 4.21 (d, J = 5.9 Hz, 1H, α-CH Ile),3.93 (t, J=6.5 Hz, 1H, α-CH Glu),2.54～2.42 (m,2H,γ-CH2Glu), 2.19～2.06 (m, 2H, β-CH2Glu),1.91～1.81 (m,1H,β-CH Ile),1.44～1.34 (m, 1H),1.22～1.12 (m,1H),0.87 (d, J =6.9Hz,3H),0.82 (t, J=7.4 Hz, 3H)。以上數(shù)據(jù)中γ-谷氨酰二肽的核磁數(shù)據(jù)與Suzuki團隊利用GGT酶合成的γ-谷氨酰二肽結(jié)構(gòu)一致。

2.2 γ-Glu-Ile產(chǎn)量的優(yōu)化

圖3 底物濃度(A)、pH值(B)和溫度(C) 對γ-Glu-Ile合成的影響Fig.3 The effect of substrate concentration (A), pH value (B) and temperature (C) on γ-Glu-Ile synthesis

注：A表示Gln∶Ile，0.05 U/mL谷氨酰胺酶在pH 9.5和37 ℃下反應(yīng)10 h。B表示Gln∶Ile 為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，0.05 U/mL谷氨酰胺酶，pH 9.5，10 h；C表示Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，0.05 U/mL谷氨酰胺酶，pH 9.5，10 h。

由圖3中A可知，Gln與Ile的摩爾濃度比對γ-Glu-Ile的產(chǎn)量具有一定的影響，根據(jù)Suzuki等人的試驗，設(shè)定Gln和Ile的濃度比為：200∶100、100∶150、100∶200、200∶200、300∶200 (mmol/L∶mmol/L)。由圖3中A可知，隨著異亮氨酸含量的增加，γ-Glu-Ile產(chǎn)量增加，而γ-Glu-Ile的含量不隨谷氨酰胺酶含量的變化而變化，說明受體氨基酸的變動對γ-Glu-Ile的產(chǎn)生具有一定的決定作用。最佳的Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，γ-Glu-Ile的最大產(chǎn)量為18.57 mmol/L，此結(jié)果與米曲霉源谷氨酰胺酶催化合成γ-谷氨酰二肽的結(jié)果接近。由圖3中B可知，γ-Glu-Ile的產(chǎn)生表現(xiàn)出pH 8～11范圍內(nèi)的依賴性，最適pH值在9～10之間，高于或低于此區(qū)間均不利于γ-Glu-Ile的產(chǎn)生，γ-Glu-Ile的產(chǎn)量為21.58 mmol/L。 由圖3中C可知，溫度對酶活的影響導(dǎo)致其催化γ-Glu-Ile產(chǎn)生量的差異，由結(jié)果可知，此酶催化γ-Glu-Ile合成的最適溫度為37 ℃，最高產(chǎn)量為21.58 mmol/L。綜上可知，此解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶催化γ-Glu-Ile合成的最適底物濃度比為Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，最適pH值在9～10之間，最適溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為10 h，最大產(chǎn)量為21.58 mmol/L。

2.3 γ-Glu-Ile對食物的增味效果

圖4 γ-Glu-Ile對A空白雞肉湯(BCB)、B空白 牛肉湯(BBB)和C醬油(SS)的影響Fig.4 The effect of γ-Glu-Ile on A blank chicken broth (BCB), B blank beef broth (BBB) and C soy sauce (SS)

表1 γ-谷氨酰肽的Kokumi閾值濃度Table 1 Kokumi threshold concentration of γ-glutamyl peptides

γ-Glu-Ile已被報道具有厚味，在發(fā)酵面團和醬油中均有發(fā)現(xiàn)[10,11]。眾所周知，將厚味γ-谷氨酰肽添加到食物中，可以增加食物的鮮、甜、咸等基本味和濃厚味[12,13]. 因此，本文試圖將厚味γ-Glu-Ile添加到雞湯、牛肉湯等物質(zhì)中，用以評價γ-Glu-Ile對這些食物滋味的改善效果，以判斷γ-Glu-Ile是否可以被用作食品添加劑。由圖4可知，將適量γ-Glu-Ile添加到雞湯、牛肉湯或者醬油中，評價雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味的改變情況，得出γ-Glu-Ile可以增加雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味(p<0.05)，此結(jié)果說明厚味γ-Glu-Ile可以作為呈味添加劑用于增加雞湯、牛肉湯和醬油等食物的味感。事實上，類似的厚味γ-谷氨酰肽，如γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Met、γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Cys-β-Ala能夠增加雞湯和牛肉湯的鮮味和濃厚味[14，15]。此外，采用滋味稀釋分析法和三選一實驗(three-alternative forced-choice)對γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值進行評價，見表1。γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值分別為(0.62±0.20)，(0.83±0.37)，(0.91±0.29)mmol/L，結(jié)果與γ-Glu-Val、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met等厚味閾值接近。

3 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶可催化γ-Glu-Ile的合成，其最佳反應(yīng)條件為：最適底物濃度比Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，最適pH值在9～10之間，最適溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為10 h，最大產(chǎn)量為21.58 mmol/L。γ-Glu-Ile可以增加雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味，且γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值分別為(0.62±0.20)，(0.83±0.37)，(0.91±0.29) mmol/L。