sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10及T淋巴細胞CD4+、CD8+在慢性乙肝患者血漿中的表達及臨床意義

柯淑慧 楊偉琴 吳炳 張涵斌

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000；2臺州市椒江區(qū)婦幼保健院檢驗科；3臺州市仙居縣中醫(yī)院檢驗科；4臺州市黃巖區(qū)婦幼保健院檢驗科)

全世界范圍內(nèi)有超過2.4億人感染慢性乙型肝炎病毒(HBV)。在乙肝最流行的亞太地區(qū)，慢性HBV感染是肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的主要原因。慢性乙型肝炎的臨床實驗表明發(fā)病機制中細胞因子白細胞介素(IL)-12與干擾素(IFN)-γ發(fā)揮很大作用?？扇苄猿绦蛐运劳鍪荏w(sPD)-1是一種表達于多種人體免疫系統(tǒng)的分子，包括T細胞、B細胞、骨髓細胞、胸腺細胞和自然殺傷細胞，sPD-1表達與癌癥和慢性感染中的T細胞衰竭有關(guān)。在HBV患者衰竭T細胞上存在的許多抑制性受體中，PD-1表達最高，特別是在肝臟內(nèi)HBV特異性T細胞上。PD-L1是PD-1的主要配體之一，通常發(fā)現(xiàn)于肝臟細胞中，在慢性感染環(huán)境中其表達增加。免疫細胞sPD-1表達上調(diào)可在病毒感染〔如HBV、人類免疫缺陷病毒(HIV)〕中檢測到，表明sPD-1可能是影響感染持續(xù)性的一個重要因素〔1〕。了解患者體檢的各項指標對臨床中患者的預(yù)后具有重要意義，此次研究通過監(jiān)測慢性乙肝患者血漿中sPD-1、IFY-γ、IL-12、IL-10指標明確其對患者預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1研究對象 選取2017年9月至2018年11月于臺州市椒江區(qū)婦幼保健院、臺州市仙居縣中醫(yī)院及臺州市黃巖區(qū)婦幼保健院三家醫(yī)院的慢性乙型肝炎患者100例，其中男80例，女20例，年齡62～75歲，其中中期慢性肝炎52例，晚期慢性重型肝炎48例。診斷符合2000年西安全國肝病會議《病毒性肝炎防治方案》的診斷規(guī)范〔2〕。根據(jù)患者的治療效果、乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)存活者長期預(yù)后及健康相關(guān)的生存質(zhì)量將其分為兩組：好轉(zhuǎn)組80例，平均年齡(65.1±3.2)歲；死亡組20例(均為晚期患者)，平均年齡(67.8±2.6)歲。選擇同期體檢的健康者100例為對照組，年齡66～78歲，平均(68.4±4.2)歲。3組一般資料均無顯著性差異，具有可比性(P<0.05)，該研究獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會的批準。

1.2觀察指標 檢測受試對象血漿中sPD-1、IL-10、IL-12、IFN-γ的含量，外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平及肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GT)。sPD-1，IL-10，IL-12、IFN-γ、ALT、AST及γ-GT 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購于Biolegend；T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+流式細胞學(xué)檢測試劑盒均購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測方法 3組均采取外周血10 ml，置于肝素抗凝管中，1 500 r/min，離心10 min，取血漿3.0 ml，保存在-80℃冰箱中，檢測時應(yīng)用37℃水浴解凍，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測血漿sPD-1，IL-10，IL-12和IFN-γ水平。取2 ml肝素抗凝血，加磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至4 ml，緩慢加至2 ml Ficoll淋巴分離液上層，2 000 r/min離心20 min后吸取單個核細胞。PBS洗滌后將細胞重懸于100 μl PBS，與抗體異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4、Percp-CD8孵育30 min，PBS洗滌2遍后重懸于500 μl PBS，在流式細胞儀Beckman Coulter Navios進行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、Pearson檢驗、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血漿中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指標的比較 好轉(zhuǎn)組與對照組sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ含量明顯低于死亡組(均P<0.05)。好轉(zhuǎn)組SPD-1、IL-12水平顯著高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿中sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ指標的比較

與死亡組相比：1)P<0.05；與對照組相比：2)P<0.05

2.2各組外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平比較 死亡組CD4+水平為(45.8±7.2)%，好轉(zhuǎn)組為(37.8±5.3)%，對照組為(46.6±3.4)%；而死亡組CD8+水平為(39.1±3.8)%，好轉(zhuǎn)組為(32.2±6.2)%，對照組為(27.1±4.7)%。死亡組和好轉(zhuǎn)組CD4+水平明顯低于對照組(P<0.05)、CD8+水平明顯高于對照組，差異顯著均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組外周血中T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平

2.3sPD-1、IL-10、IL-12和IFN-γ與肝功能指標的相關(guān)性 與對照組相比，好轉(zhuǎn)組和死亡組ALT、AST、γ-GT均顯著升高(均P<0.05)。見表2。sPD-1、CD4+水平與肝功能指標(ALT、AST、γ-GT)呈正相關(guān)(r=0.639、0.712、0.598、0.726、0.703、0.608，均P<0.05)；IL-10水平與ALT、AST、γ-GT呈正相關(guān)(r=0.546、0.642、0.575，均P<0.05)；IL-12、IFN-γ與肝功能指標無明顯相關(guān)。

表2 各組肝功能指標的比較

與對照組相比：1)P<0.05

2.4sPD-1、IL-10對慢性重型肝炎的預(yù)后分析 Logistic回歸模型顯示，血漿內(nèi)sPD-1、IL-10含量高的患者風險較大(sPD-1:HR=1.002,95%CI:0.780～1.262;IL-10:HR=1.005,95%CI:0.653～1.482)。

3 討 論

慢性乙型肝炎后期表現(xiàn)有乏力、納差、腹脹等，可伴有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣或肝脾腫大。慢性乙型肝炎患者病情不同階段生理表達不同，早期呈現(xiàn)細胞因子IL-10大量分泌，早期是醫(yī)治痊愈的最好時期，中期到后期IL-12與ILN-γ的含量極速增長，早期應(yīng)用肝細胞生長素可降低病死率〔3〕。IFN-γ、IL-12和IL-10代表體內(nèi)Th1與 Th2反應(yīng)，(IFN-γ+ IL-12)/IL-10比值變化代表人體免疫反應(yīng)的方向，如果比值偏小，則提示慢性化可能，Child-Pugh、終末期肝病模型(MELD)和白蛋白-膽紅素(ALBI)評分預(yù)測肝硬化合并慢加急性肝衰竭患者院內(nèi)死亡風險〔4〕，如果比值偏大，則提示機體含有劇烈的免疫反應(yīng)。若早期細胞因子IL-10分泌則該患者痊愈概率大，若觀察指標含量以IFN-γ與IL-12的增多為主，且遠遠高于正常指標含量，則可判斷該患者為慢性重型肝死亡。慢性肝炎患者在不同病情階段血漿中各指標含量不同，早期以IL-10含量增多為主?；颊咄嬖趪乐氐难“鍦p少現(xiàn)象，晚期則以IFN-γ和IL-12分泌含量快速增長為主。肝衰竭死亡時期依次隨時間推移IL-12與IFY-γ含量增多，抑制細胞因子分泌是防治慢性肝炎的可能的方法之一。

慢性乙型肝炎病毒感染的過程是一個動態(tài)的過程，是病毒復(fù)制和宿主免疫相互作用的結(jié)果。T細胞異常表達免疫分子參與慢性乙肝的病理過程〔5～7〕，機體感染乙肝病毒后可發(fā)生T淋巴細胞亞群改變。PD-1為近年發(fā)現(xiàn)的T細胞表面CD28家族新成員〔8～10〕，但PD-1在乙肝中的具體機制不明確，有研究表明PD-1介導(dǎo)的負向調(diào)控與慢性病毒感染有密切關(guān)系〔11～13〕。研究證實，抑制T細胞過度表達的PD-1及其受體PD-L1可有效抑制乙肝病毒，有望成為治療肝癌的新型治療方法〔14～21〕。