轉(zhuǎn)移性直腸腺癌潛在生物標(biāo)志物的鑒定

馬秀坤 洪洙 劉翔龍 華揚(yáng)

(1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院外科，天津 300120；2天津市人民醫(yī)院肛腸中心)

直腸腺癌(RAC) 是直腸癌中一種主要的組織學(xué)類型，具有相當(dāng)高的死亡率和病發(fā)率，5年總體的存活率為66.5%〔1～4〕。對(duì)于早期RAC患者來(lái)說(shuō)，手術(shù)切除是唯一的治療方法。對(duì)于局部中晚期RAC患者，手術(shù)與術(shù)前輔助放化療結(jié)合能夠提高患者的5年總存活率〔5〕。雖然術(shù)前放療可有效降低RAC的再發(fā)生率，但尚未有研究證明其能改善患者的整體預(yù)后，大多數(shù)情況下治療的失敗最終都源自遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移〔6～8〕。據(jù)報(bào)道遺傳易感性、基因失調(diào)、吸煙和肥胖之間的多因素交叉可能導(dǎo)致RAC的進(jìn)展〔4〕。有研究表明miR-144通過(guò)靶向Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶(ROCK)-1抑制直腸癌細(xì)胞的遷移和增殖〔9〕，miR-19a能夠介導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的由內(nèi)皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程〔10〕。在中國(guó)漢族人群中，磷脂酶Cε1基因(PLCE1)的多態(tài)性也與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)〔11〕。韓國(guó)患者中，RAN rs14035、DICER1 rs3742330、核輸出蛋白(XPO)5 rs11077、DROSHA rs10719的變化與患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)〔12〕。但是目前針對(duì)RAC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制還尚不清楚。本研究采用生物信息學(xué)方法，將腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中RAC的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合并按照RAC轉(zhuǎn)移患者與未轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行分類，探討RAC轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制并確定RAC轉(zhuǎn)移的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載有無(wú)轉(zhuǎn)移的RAC患者的mRNA基因表達(dá)譜 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共有171例RAC患者的數(shù)據(jù)可用。從TCGA數(shù)據(jù)門戶(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)獲取RAC患者的臨床記錄(截至2015年4月7日)和基因表達(dá)譜。RAC患者的基因表達(dá)譜在本研究中的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)屬于RAC患者的原發(fā)性腫瘤；(2)患者沒(méi)有惡性腫瘤史；(3)患者在收集腫瘤樣本前未接受任何治療。最終共有150例患者的基因表達(dá)譜納入本研究，并根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)腫瘤分期(AJCC TNM)系統(tǒng)將患者分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組〔1〕?；虮磉_(dá)譜的數(shù)據(jù)集分別基于IlluminaHiSeq RNASeqV2和IlluminaGA RNASeq。

1.2RAC患者轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組間的差異表達(dá)基因分析 下載納入本研究的RAC患者的三級(jí)表達(dá)數(shù)據(jù)，采用R語(yǔ)言的DESeq2包在轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組之間分別篩選出3個(gè)數(shù)據(jù)集中的失調(diào)基因〔13〕。在3個(gè)數(shù)據(jù)集中，重疊失調(diào)基因被識(shí)別為與RAC轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因(DGEs)。計(jì)算DEGs顯著性的P值并采用斯托弗(Stouffer Z-score)方法結(jié)合P值〔14〕。采用偽發(fā)現(xiàn)率 (FDR) 對(duì)原始P值進(jìn)行多次測(cè)試校正并將DEGs的閾值設(shè)為FDR<0.05〔15〕。兩組間DEGs均進(jìn)行熱圖分析，用于評(píng)價(jià)兩樣本間基因表達(dá)模式的相似性。熱圖是用R語(yǔ)言中的pheatmap包構(gòu)建的〔16〕。

1.3基因功能注釋 為了獲得DEGs的生物學(xué)作用和信號(hào)通路，利用在線軟件BinGo和GeneCodis3進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)的通路富集〔17，18〕。FDR<0.05是篩選顯著富集GO功能和KEGG通路的閾值。

1.4蛋白-蛋白相互作用 為了深入了解與RAC轉(zhuǎn)移相關(guān)的DEGs之間的相互作用，利用已知和預(yù)測(cè)蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)BioGRID構(gòu)建了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)〔19〕，然后用Cytoscape軟件 (http：//cytoscape.org/)對(duì)PPI進(jìn)行可視化〔20〕。

1.5實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 為了驗(yàn)證DEGs在轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組之間的表達(dá)水平，對(duì)收集的RAC腫瘤組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。采用Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，CA，USA)合成cDNA，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)在Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)源性控制基因，將每一項(xiàng)測(cè)驗(yàn)重復(fù)3次，并用CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量〔21〕。所用引物如表1所示，使用GraphPad Prism6.0版軟件包(GraphPad software，San Diego，CA，USA)輸出實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

表1 qRT-PCR檢測(cè)中的基因引物

2 結(jié) 果

2.1與RAC轉(zhuǎn)移相關(guān)的DEGs的鑒定 150例RAC患者中，分別有70例納入轉(zhuǎn)移組和80例納入非轉(zhuǎn)移組。RNASeq UNC IlluminaGA_RNASeq平臺(tái)轉(zhuǎn)移29例，非轉(zhuǎn)移43例；RNASeqV2 UNC IlluminaHiseq_RNASeqV2平臺(tái)轉(zhuǎn)移41例，非轉(zhuǎn)移37例。轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組共發(fā)現(xiàn)67個(gè)DEGs，其中上調(diào)DEGs 50個(gè)，下調(diào)DEGs 17個(gè)。如表2所示，結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白1(C11orf92)、Kelch樣家族成員(KLHL)32、程序性細(xì)胞死亡蛋白1配體(CD274)為顯著上調(diào)的DEGs；神經(jīng)外營(yíng)養(yǎng)蛋白(NXPH)4、細(xì)胞周期蛋白(CCN)D3、載脂蛋白(APO)D為明顯下調(diào)的DEGs。

2.2DEGs的功能注釋 為探討經(jīng)鑒定的DEGs在RAC轉(zhuǎn)移中的功能意義，對(duì)67個(gè)DEGs進(jìn)行GO功能和KGGG富集分析。在生物響應(yīng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，維生素D對(duì)細(xì)胞色素P450家族24亞家族A成員(CYP24A)1、磷脂酶A2組IVA(PLA2G4A)和水通道蛋白(AQP)3有顯著的富集作用 (圖1A，表3)。醛脫氫酶1家族成員(ALDH1)A2、APOD、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP)2在類維生素A結(jié)合分子功能上顯著富集 (圖1B，表3)。此外，GO術(shù)語(yǔ)的細(xì)胞注釋中沒(méi)有出現(xiàn)DEGs的富集。胰腺分泌(hsa04972)和細(xì)胞黏附分子(hsa04514)是顯著富集的通路(表3)。

2.3PPI 如圖2所示，網(wǎng)絡(luò)由494個(gè)節(jié)點(diǎn)，479條邊組成。本研究將與基因連接度高的節(jié)點(diǎn)定義為樞紐蛋白，并將與基因連接度簡(jiǎn)稱為degree。CCND3 (degree=48)、CD274 (degree=46)和泛素相關(guān)結(jié)合域蛋白(UBAC)2(degree=45)是PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的3個(gè)樞紐蛋白。

2.4通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證DEGs的表達(dá)水平 為了驗(yàn)證通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析鑒定出的RAC轉(zhuǎn)移中的DEGs，采用qRT-PCR方法對(duì)5例RAC轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)腫瘤組織和5例未轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤組織中DEGs的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見表4，RAC轉(zhuǎn)移組的CCND3、AQP3、父系表達(dá)蛋白(PEG)10、RAB27B較非轉(zhuǎn)移組有上調(diào)趨勢(shì)。編碼腺苷酸環(huán)化酶(ADCY)1在RAC轉(zhuǎn)移組較非轉(zhuǎn)移組有下調(diào)趨勢(shì)。

表2 與直腸腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的前10位上調(diào)DEGs和 下調(diào)DEGs

A.DEGs的生物反應(yīng)過(guò)程富集；B.DEGs的分子功能性富集?；疑?jié)點(diǎn)表示DEGs的富集的GO術(shù)語(yǔ)圖1 通過(guò)BINGO軟件對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集

表3 DEGs在RAC轉(zhuǎn)移中的功能注釋

名稱術(shù)語(yǔ)數(shù)目FDR基因KEGG 通路hsa04972胰腺分泌30.041ADCY1,RAB27B,PLA2G4Ahsa04514細(xì)胞黏附分子(CAMs)30.041NRCAM,CLDN18,CD274GO 富集-生物過(guò)程33280維生素D反應(yīng)30.023CYP24A1,PLA2G4A,AQP3GO 富集-分子功能5501維生素A類結(jié)合30.017ALDH1A2,APOD,CRABP219840類異戊二烯結(jié)合30.017ALDH1A2,APOD,CRABP2

白色和灰色節(jié)點(diǎn)分別代表上調(diào)和下調(diào)DEGs，黑色節(jié)點(diǎn)代表與DEGs相互作用的基因產(chǎn)物。實(shí)線表示兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用。節(jié)點(diǎn)大小代表DEG在RAC表達(dá)的顯著程度，節(jié)點(diǎn)越大表示該DEG在RAC表達(dá)越顯著圖2 67個(gè)失調(diào)DEGs的PPI

表4 qRT-PCR方法驗(yàn)證候選基因的表達(dá)

3 討 論

CCND3位于染色體6p21，編碼cyclin D3，屬于高度保守的cyclin家族。CCND3是PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白。由于細(xì)胞周期蛋白D1對(duì)細(xì)胞周期中G1/S期會(huì)產(chǎn)生影響，通過(guò)此特性發(fā)現(xiàn)其參與了包括結(jié)直腸腺癌(CRC)、非小細(xì)胞肺癌和胃癌在內(nèi)的多種癌癥的進(jìn)展〔22～24〕。在結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移發(fā)展過(guò)程中，CCND3升高與血管浸潤(rùn)和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，降低了疾病特異性生存率〔22〕。與結(jié)腸直腸癌的原發(fā)性病變相比，肝臟轉(zhuǎn)移灶中的CCND3明顯上調(diào)〔25〕。結(jié)腸癌和直腸癌的基因表達(dá)譜存在差異，表明個(gè)體發(fā)育也存在差異性〔26〕。目前尚無(wú)CCND3在結(jié)腸直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用研究。

本研究中，與非轉(zhuǎn)移組相比，AQP3在RAC轉(zhuǎn)移過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，并在生物過(guò)程中對(duì)維生素D的反應(yīng)中富集。AQP3參與細(xì)胞的攻擊性、侵襲性和遷移，在結(jié)腸癌、胃癌、食管鱗癌、胰腺癌等多種癌癥中均有升高〔27～30〕。AQP1、AQP3、AQP5過(guò)高水平的表達(dá)與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)〔28〕。上調(diào)AQP3促進(jìn)胃癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，與胃癌細(xì)胞遷移、侵襲性及預(yù)后不良相關(guān)〔27〕。表皮生長(zhǎng)因子促使AQP3上調(diào)，上調(diào)的AQP3可通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移〔29〕，這是首次關(guān)于AQP3在RAC轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生異常的報(bào)道，尚需進(jìn)一步研究。

PEG10，一類父系表達(dá)基因，在RAC轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)顯著上調(diào) 。PEG10的異位過(guò)量表達(dá)通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)并抑制乳腺癌和肺癌中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔30～32〕。在肝細(xì)胞癌中，PEG10的表達(dá)與總體生存和腫瘤復(fù)發(fā)的不良預(yù)后有關(guān)〔33〕。PEG10在結(jié)腸直腸癌類型和RAC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。綜上所述，PEG10的過(guò)量表達(dá)可能在RAC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

RAB27B是RAS致癌基因家族成員。RAB27B在結(jié)腸直腸癌中的作用存在爭(zhēng)議，因?yàn)檠芯繄?bào)道其上調(diào)和下調(diào)均與結(jié)腸直腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)〔34，35〕。有報(bào)道顯示RAB27B的表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)中與其匹配的非癌組織，表明其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和結(jié)腸直腸癌TNM分期相關(guān)〔35〕。研究表明，RAB27B的陰性表達(dá)與CRC中腫瘤分化不良、血管浸潤(rùn)陽(yáng)性顯著相關(guān)〔34〕。在本研究中，RAB27B在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)上調(diào)。RAB27B表達(dá)異常與RAC轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析還需要通過(guò)大樣本的RAC患者進(jìn)行臨床實(shí)踐。

ADCY1是腺苷酸環(huán)化酶基因家族的一員。據(jù)報(bào)道ADCY1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中被高度甲基化〔36〕。ADCY1的下調(diào)在RAC中的生物學(xué)作用還有待闡明。RAC中失調(diào)的ADCY1和RAB27B在胰腺分泌通路中出現(xiàn)顯著富集。通過(guò)比較RAC轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組得到的67個(gè)DEGs的研究分析表明胰腺分泌和細(xì)胞黏附分子通路顯著富集。

綜上所述，CCND3是網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白，ADCY1可能通過(guò)胰腺分泌和細(xì)胞黏附分子途徑，與AQP3、PEG10、RAB27B一起在RAC的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些研究發(fā)現(xiàn)可能為RAC提供有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。本研究是在RAC中首次基于RAN-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析的報(bào)告。這些DEGs和通路在RAC轉(zhuǎn)移中的作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究。