Box-Behnken中心組合設(shè)計研發(fā)新型開菲爾乳酒

文星科，王琪，2，劉琨毅，3，*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650000）

我國傳統(tǒng)的開菲爾乳酒是在鮮奶中加入天然發(fā)酵劑，經(jīng)自然發(fā)酵形成，但由于天然發(fā)酵劑中菌群結(jié)構(gòu)各異致使傳統(tǒng)乳酒產(chǎn)品質(zhì)量經(jīng)常出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象[1-4]。因此菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且能顯著提高乳酒感官特性的發(fā)酵劑將受到廣泛地關(guān)注[5-8]。閔建等發(fā)現(xiàn)制備乳酒時使用兩種及兩種以上菌種可以提供產(chǎn)品質(zhì)量，當(dāng)酵母菌聯(lián)合乳酸菌，乳酒的品質(zhì)能得到顯著提升[9-12]。由開菲爾菌生產(chǎn)的開菲爾酸奶不僅與普通酸奶有類似的營養(yǎng)價值，而且具有一定的保健功能[13-16]。當(dāng)釀酒酵母與其他適宜的微生物混合作為發(fā)酵劑發(fā)酵酒品時，可以改善酒品的風(fēng)味，增強酒品的香氣特征[17-20]。因此試驗以開菲爾菌與釀酒酵母為發(fā)酵劑制備新型開菲爾乳酒，并通過優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，以期開發(fā)出一種酒體風(fēng)味優(yōu)雅、口感幼滑、酸度適中的新型開菲爾乳酒，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069、開菲爾菌粒（Kefir）：宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心；純牛奶（乳糖含量4.5%）、白砂糖：市售；檸檬酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、乙酸鈉、磷酸氫鈉、乙醚等（均為分析純）：成都科龍有限公司；2-辛醇：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱：青島明成環(huán)?？萍加邢薰?；FA20043型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺、PHS-25型精密pH計：上海力辰科技有限公司；KL-30-10000型乳化均質(zhì)機：上?？苿跈C械設(shè)備有限公司；AT6000型酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司；GC126型氣相色譜儀、DB-Wax（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱：美國安捷倫公司。

1.3 開菲爾乳酒發(fā)酵工藝流程

牛奶、白砂糖、亞硫酸鈉→加熱至60℃→15 MPa壓力條件下均質(zhì)→90℃加熱殺菌5 min→冷卻→接入開菲爾菌粒與釀酒酵母→發(fā)酵→后熟→成品

操作要點：在牛奶中添加一定比例的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，利用檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6.5，過濾后加熱至60℃，進入乳化均質(zhì)機（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90℃加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液和開菲爾菌粒，25℃發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 理化指標(biāo)測定方法

總糖（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法[21]；酒精體積分?jǐn)?shù)測定：密度瓶法[21]；總酸測定：電位滴定法[21]；氨基酸態(tài)氮測定：甲醛滴定法[21]。

1.4.2 乙酸乙酯的檢測

乙酸乙酯的檢測采用液-液微萃取法提取和氣相色譜法定量分析[22-23]。在5 mL發(fā)酵液中分別加入5 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇）和500 μL乙醚。待乙醚充分萃取后取有機相進行色譜分析。色譜條件為：進樣口溫度設(shè)定為250℃，取1 μL的樣品，設(shè)置分流比1∶1，載氣流速2 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min。升溫條件為：起始溫度150℃，保持3 min，隨后以10℃/min的升溫速率升溫至230℃，保留2 min。

1.4.3 感官評價

由13位三級品酒師組成的評定小組參照王璐等對馬奶酒發(fā)酵條件的研究[2]及GB/T 23546-2009《奶酒》[21]對新型開菲爾乳酒從色澤（滿分5分）、組織形態(tài)（滿分5分）、香氣（滿分30分）、滋味（滿分40分）、典型性（滿分20分）5個方面進行感官評價，如表1所示。

表1 新型開菲爾乳酒的評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standards of new Kefir koumiss

1.4.4 開菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、開菲爾粒接種量（0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%）、釀酒酵母接種量（0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發(fā)酵時間（2、3、4、5、6 d）對新型開菲爾乳酒感官評分及乙酸乙酯含量的影響，以確定較佳的白砂糖添加量、開菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時間。

1.4.5 開菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在較優(yōu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，進行分析試驗[24]，以確定新型開菲爾乳酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

表2 新型開菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

1.5 數(shù)據(jù)分析處理方法

試驗采用OriginPro 12.1軟件進行數(shù)據(jù)制圖，PASW Statistics 18軟件進行數(shù)據(jù)分析，Design Expert 10.1軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 白砂糖添加量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 白砂糖添加量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of sugar addition on quality of new Kefir koumiss

由圖1可知，當(dāng)開菲爾乳酒中白砂糖添加量從6%增加到12%，開菲爾乳酒的感官評分也隨之增加；當(dāng)添加量達(dá)到12%時，開菲爾乳酒的感官評分達(dá)到最高分（82.3±0.8）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，開菲爾乳酒的感官評分開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。發(fā)酵醪液中乙酸乙酯的含量隨白砂糖添加量的增加而增加，最高達(dá)到了（0.75±0.02）g/L。可發(fā)酵性糖在開菲爾乳酒發(fā)酵過程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[8]。開菲爾乳酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖偏少會出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，而可發(fā)酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為10%、12%及14%用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗。

2.1.2 開菲爾粒接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響

開菲爾粒主要由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌及明串珠菌等多種微生物組成，在開菲爾乳酒發(fā)酵過程中會產(chǎn)生丁二酮、乙醇、丙醛、羥丁酮等揮發(fā)性羰基化合物，從而賦予開菲爾乳酒獨特的風(fēng)味[13，25]。其用量的多少將直接決定著開菲爾乳酒質(zhì)量的好壞，開菲爾粒接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響如圖2所示。

圖2 開菲爾粒接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Kefir inoculums on quality of new Kefir koumiss

由圖2可知，開菲爾乳酒的感官評分隨著開菲爾粒接種量的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，當(dāng)開菲爾粒接種量為1.2%時，開菲爾乳酒的感官評分達(dá)到最高的（80.2±0.6）分。因開菲爾粒接種量不足會造成開菲爾乳酒發(fā)酵不完全，酸味不足、香味較寡淡等不良特征，接種量過大又會使開菲爾乳酒呈現(xiàn)出較高的酸度，甚至出現(xiàn)苦味（特別是在開菲爾粒接種量為1.8%時）。但開菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量隨開菲爾粒接種量的增加而呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢，最高達(dá)到了（0.71±0.05）g/L。綜合感官評分與乙酸乙酯的含量變化，選擇開菲爾粒接種量為0.9%、1.2%、1.5%作為后續(xù)響應(yīng)面試驗的因素水平。

2.1.3 釀酒酵母接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響

釀酒酵母接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 釀酒酵母接種量對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiaeon inoculums on quality of new Kefir koumiss

由圖3可知，當(dāng)釀酒酵母接種量在0.4%以內(nèi)變化時，開菲爾乳酒的感官評分隨著釀酒酵母接種量的增加而不斷增加。當(dāng)釀酒酵母接種量為0.4%時，開菲爾乳酒的感官評分達(dá)到最高的（82.4±0.9）分。釀酒酵母在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時還會產(chǎn)生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[17-18]。當(dāng)釀酒酵母接種量偏低時，容易使釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成開菲爾乳酒酒度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)釀酒酵母的接種量為0.5%時，其開菲爾乳酒的感官評分較釀酒酵母接種量為0.4%時略有下降，但兩者并無顯著性差異（p＞0.05）。開菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量隨酵母接種量的增加而不斷增加，最高達(dá)到了（0.79±0.04）g/L。因此，選擇釀酒酵母接種量為0.3%～0.5%用于響應(yīng)面法試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對新型開菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on quality of new Kefir koumiss

由圖4可知，開菲爾乳酒的感官評分隨著發(fā)酵時間的延長而增加，當(dāng)發(fā)酵時間為6 d時，開菲爾乳酒的感官評分達(dá)到最高的（82.0±0.5）分。雖然開菲爾乳酒的感官評分在其發(fā)酵5 d時較發(fā)酵6 d時偏低，但二者并無顯著性差異（p＞0.05）。開菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量也隨發(fā)酵時間的延長而增加，當(dāng)發(fā)酵時間為6 d時，開菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量達(dá)到了（0.87±0.05）g/L。當(dāng)發(fā)酵時間少于5 d時，醪液中的可發(fā)酵性糖還未完全被微生物所利用，酒體略顯寡淡，乙酸乙酯等酒香物質(zhì)含量偏低，使得開菲爾乳酒的酒香不夠濃郁。因此選擇發(fā)酵時間為4、5、6 d用于后續(xù)試驗。

2.2 響應(yīng)面法試驗

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理與試驗，對白砂糖添加量、開菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時間4個因素分析得到以下試驗方案及結(jié)果見表3。

表3 新型開菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

再通過Design-Expert軟件對響應(yīng)面法試驗得到的感官評分與乙酸乙酯含量進行方差分析，得到結(jié)果如表4與表5所示。

表4 感官評分的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model for sensory score

表5 乙酸乙酯含量的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for the content of ethyl acetate

由表4可知，4個因素對新型開菲爾乳酒感官評分影響的強弱順序依次為：白砂糖添加量＞開菲爾粒接種量＞發(fā)酵時間＞釀酒酵母接種量，其中白砂糖添加量對開菲爾乳酒感官評分的影響極為顯著（p＜0.01）。白砂糖添加量與開菲爾粒接種量之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）。設(shè)白砂糖添加量、開菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時間分別為A、B、C、D，以新型開菲爾乳酒的感官評分為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，得到新型開菲爾乳酒感官評分回歸方程：新型開菲爾乳酒感官評分=87.48+1.85A-0.66B+0.19C-0.65D-2.25AB-0.025AC+0.62AD+0.27BC-0.85BD-1.02CD-3.15A2-4.44B2-2.74C2-1.62D2

由表5知，A、B、C、D 4個因素中A因素對新型開菲爾乳酒乙酸乙酯含量的影響顯著（p＜0.05），交互項AB對乙酸乙酯含量的影響顯著（p＜0.05），二次項A2、B2、C2、D2對乙酸乙酯含量的影響極顯著（p＜0.01），得到的新型開菲爾乳酒乙酸乙酯含量的回歸方程：乙酸乙酯含量=0.900+0.0140A-0.007B+0.007C-0.007D-0.023AB-0.015AC+0.006AD+0.003BC-0.009BD-0.010CD-0.035A2-0.054B2-0.029C2-0.025D2

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[26-30]。根據(jù)新型開菲爾乳酒感官評分回歸方程與乙酸乙酯含量的回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果見圖5與圖6。

圖5 各因素交互作用對新型開菲爾乳酒感官評分的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of new Kefir koumiss

由圖5知，A（白砂糖添加量）與B（開菲爾粒接種量）之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭即A與B相互之間具有最強的交互作用。該結(jié)果與表4方差分析所得的白砂糖添加量與開菲爾粒接種量之間具有顯著的交互作用（p<0.05）的結(jié)論相吻合。

圖6 各因素交互作用對新型開菲爾乳酒乙酸乙酯含量的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on the content of ethyl acetate in new Kefir koumiss

由圖6知，A與B之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在乙酸乙酯含量為響應(yīng)值的兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭即A與B相互之間具有最強的交互作用，與表5方差分析的結(jié)論相吻合。

通過響應(yīng)面分析確定新型開菲爾乳酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量12.89%、開菲爾粒接種量1.19%、釀酒酵母接種量0.43%及發(fā)酵時間4.82 d，此條件下由公式算出的感官評分與乙酸乙酯含量的理論值分別為87.86分、0.954 g/L。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進行3組驗證試驗，驗證試驗的條件為白砂糖添加量12.9%、開菲爾粒接種量1.2%、釀酒酵母接種量0.4%及發(fā)酵時間115 h，得到新型開菲爾乳酒的感官評分為（88.1±0.3）分、乙酸乙酯的含量為（0.95±0.01）g/L，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 開菲爾乳酒的理化分析及感官分析

測定在最佳發(fā)酵工藝條件下新型開菲爾乳酒（Z1）及在最佳發(fā)酵工藝條件下但未接入釀酒酵母的開菲爾乳酒（Z0）的總糖、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙酸乙酯等理化指標(biāo)及感官評分，其數(shù)值見表6。

由表6可知，Z1的酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙酸乙酯及感官評分均高于Z0，特別是乙酸乙酯的含量是Z0的1.76倍，表明釀酒酵母在新型開菲爾乳酒發(fā)酵過程中能賦予產(chǎn)品風(fēng)味特別是能賦予更加濃郁的乙酸乙酯酒香進而提高產(chǎn)品的感官特性。其原因是釀酒酵母與醋酸菌等其它微生物共同接入發(fā)酵醪液中，會促進乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)的生成[31-32]。Z1呈現(xiàn)出色澤微黃、澄清透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤、醇厚協(xié)調(diào)的感官特性；而Z0在酒香和酒體滋味方面較Z1有所欠缺，因而開菲爾菌與釀酒酵母混合發(fā)酵有利于提高新型開菲爾乳酒的感官特性。

表6 兩種開菲爾乳酒的理化指標(biāo)及感官評分Table 6 Physicochemical indexes and sensory scores of two kinds of Kefir koumiss

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對新型開菲爾乳酒的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，確定了其最優(yōu)工藝條件為：在牛奶中添加12.9%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，過濾后加熱至60℃，進入乳化均質(zhì)機（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90℃加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入1.2%的開菲爾粒和經(jīng)活化后的0.4%釀酒酵母懸液，25℃發(fā)酵115 h后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤的開菲爾乳酒，其感官評分為88.1分、乙酸乙酯的含量為0.95 g/L。若需將此開菲爾乳酒進行工業(yè)化生產(chǎn)還需對酒體進一步勾調(diào)及澄清處理，使其感官特性符合商品要求。