響應(yīng)面法優(yōu)化舟山小帶魚(yú)蛋白抗菌肽制備工藝及其抑菌效果分析

何定芬，鄭霖波，周英杰，毛鵬權(quán)，葉常青，謝超，*

（1.浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山316021；2.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；3.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江舟山316022）

帶魚(yú)（Trichiurus lepturu），在我國(guó)[1]乃至全世界[2]，都是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)品種，是海洋漁業(yè)中的重要組成部分[3]。帶魚(yú)不僅肉質(zhì)鮮美，口感順滑，而且富含人體所必需的各類(lèi)蛋白質(zhì)，微量元素等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常之高，是非常受歡迎的食品種類(lèi)[4]。

我國(guó)帶魚(yú)年捕獲量達(dá)到120萬(wàn)噸，其中夾帶的低值小帶魚(yú)的比例在20%以上，且舟山作為中國(guó)最大的漁場(chǎng)，年捕撈量巨大，所以魚(yú)類(lèi)生產(chǎn)加工的原料非常豐富。目前低值小帶魚(yú)的加工方式較單一，主要是加工成飼料，缺乏高值化的加工方式，資源利用率低下，急需提高利用率[5]。目前國(guó)內(nèi)外利用水產(chǎn)品制備抗菌肽的主要原料為魷魚(yú)[6]、羅非魚(yú)[7]、大黃魚(yú)[8]等，利用低值小帶魚(yú)制備抗菌肽的研究在我國(guó)鮮見(jiàn)報(bào)道。

量產(chǎn)制備抗菌肽最優(yōu)的方法是酶解法，因酶解條件溫和易控制無(wú)公害，被公認(rèn)為最有前景的抗菌肽制備法[9]。故本研究以低值舟山小帶魚(yú)為原料，選用復(fù)合酶解法制備小帶魚(yú)抗菌肽，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定復(fù)合酶種類(lèi)，再結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，并對(duì)其純化，為小帶魚(yú)抗菌肽的制備提供理論依據(jù)，帶來(lái)一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舟山小帶魚(yú)，購(gòu)于舟山老碶菜場(chǎng)，購(gòu)買(mǎi)時(shí)將小帶魚(yú)放在加碎冰的泡沫箱中保存，在40 min內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，人工去除帶魚(yú)頭部及內(nèi)臟組織，在高速組織搗碎機(jī)中處理，得到小帶魚(yú)糜，將小帶魚(yú)糜裝入保鮮袋中，每袋100 g，在-20℃環(huán)境下貯藏。試驗(yàn)時(shí)提前24 h將小帶魚(yú)糜取出，在4℃的冰箱冷藏室中解凍備用。

試驗(yàn)用酶見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)用酶Table 1 Experimental enzymes

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見(jiàn)表2。

表2 儀器與設(shè)備Table 2 Instruments and equipment

1.3 方法

1.3.1 小帶魚(yú)抗菌肽的制備

取解凍好的舟山小帶魚(yú)糜10 g，溶于100 mL純水中，調(diào)節(jié)pH值以及溫度，到達(dá)蛋白酶的最適酶解pH值和溫度，加入0.2 g/100 mL的蛋白酶[10]；為獲得好的酶解效果，在磁力攪拌機(jī)中攪拌10 min；放入180 r/min的搖床中酶解[11]。酶解完成后將酶解液進(jìn)行滅酶處理（電熱恒溫水浴，95℃～100℃，20 min）。取滅酶后酶解液進(jìn)行離心處理（4℃，8 000 r/min，15 min），離心完成后將中間清液取出，利用10 mL的離心管保存，保存時(shí)的環(huán)境溫度控制在-20℃，并對(duì)其封口以防受污染，以備后續(xù)使用。

1.3.2 抑菌效果的測(cè)定

采用Dionysius DA等[12]的光密度法測(cè)定蛋白酶解液的抑菌效果，部分進(jìn)行修改。選取指示菌為大腸桿菌，菌齡為18 h～24 h，菌濃度為107CFU/mL。各蛋白酶解液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，調(diào)節(jié)成一致濃度，各取2 mL，加入10 mL肉湯液體培養(yǎng)基中；同時(shí)加入200 μL指示菌，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定其吸光值（A樣品）。不加入菌懸液，剩余條件相同的為空白樣品，測(cè)定其吸光值（A空樣）；2 mL滅菌生理鹽水代替2 mL蛋白酶解液，剩余條件相同的為對(duì)照樣品，測(cè)定其吸光值（A對(duì)照）。所有樣品均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。試驗(yàn)空白調(diào)零10 mL肉湯液體培養(yǎng)基和2 mL滅菌生理鹽水混合液；測(cè)定吸光值時(shí)波長(zhǎng)為570 nm，計(jì)算公式為式（1）：

1.3.3 酶的篩選

選用胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶在各蛋白酶的最適酶解條件下進(jìn)行酶解，獲得酶解液。測(cè)定酶解液的抑菌率，通過(guò)對(duì)比抑菌率，選取兩種抑菌效果最好的酶作為復(fù)合酶，復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶1。最適酶解條件及添加量[13]見(jiàn)表3。

表3 二次酶酶解條件及添加量Table 3 Secondary enzyme enzymatic hydrolysis conditions and addition amount

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在確定復(fù)合酶的篩選后，根據(jù)1.3.1節(jié)方法制備小帶魚(yú)抗菌肽，進(jìn)行3個(gè)因素的試驗(yàn)：復(fù)合酶酶解時(shí)間（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h）、復(fù)合酶酶解溫度（25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45 ℃）以及復(fù)合酶酶解pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），單獨(dú)考察上述變量下酶解液的抑菌效果，通過(guò)比較抑菌效果確定復(fù)合酶解各因素的最佳值。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用軟件Design-Expert 11.0進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定復(fù)合酶解過(guò)程中的最適條件。響應(yīng)面試驗(yàn)三因素為復(fù)合酶解時(shí)間、溫度、pH值；響應(yīng)值為抗菌率，最終得出優(yōu)化結(jié)果。

1.3.6 水解度及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法[14]，水解度計(jì)算公式為式（2）：

采用凱氏定氮法[15]測(cè)定酶解液中蛋白質(zhì)濃度，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.7 Sephadex G-25凝膠層析分離

最佳復(fù)合酶解條件下酶解制得小帶魚(yú)酶解液粗品，對(duì)粗品使用超濾法[16]獲得超濾樣品后用Sephadex G-25凝膠層析柱進(jìn)行層析分離[17]，測(cè)定280 nm[18]處吸光值。收集每一組分進(jìn)行抑菌率的測(cè)定，選取抑菌率最好的組分進(jìn)行下一步純化。

1.3.8 反相高效液相色譜純化

取1.3.7節(jié)獲得的組分，采用莫加利等[19]的方法進(jìn)行反相高效液相色譜純化，測(cè)定280 nm處的吸光值。對(duì)每一組分進(jìn)行抑菌率測(cè)定，選取最佳組分，達(dá)到純化目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶酶解液對(duì)指示菌的抑菌效果見(jiàn)圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解液對(duì)指示菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different protease hydrolysates on indicator bacteria

由圖1可知，抑菌效果最強(qiáng)的蛋白酶種類(lèi)為胃蛋白酶，其酶解得到的小帶魚(yú)酶解液抑菌率達(dá)到33.68%；木瓜蛋白酶酶解所得的小帶魚(yú)酶解液抑菌率次之，達(dá)到15.81%；而效果較差的是胰蛋白酶酶解得到的小帶魚(yú)酶解液，抑菌率為6.42%。風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌性，甚至對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)可能存在不同程度的促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)比抑菌率，本試驗(yàn)驗(yàn)最終選取復(fù)合酶制劑組合為胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，以此復(fù)合酶酶解制備小帶魚(yú)抗菌肽。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 復(fù)合酶酶解時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶酶解溫度35℃，pH 4.5。自變量為復(fù)合酶酶解時(shí)間，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合酶酶解時(shí)間對(duì)酶解液抑菌率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibition rate of enzymatic hydrolysate

分析圖2可得，在復(fù)合酶解時(shí)間從2 h延長(zhǎng)到4 h的過(guò)程中，酶解液抑菌率呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且在4 h的時(shí)候達(dá)到最高值，抑菌率為42.86%；出現(xiàn)此趨勢(shì)的原因是伴隨酶解時(shí)長(zhǎng)的增加，有抑菌作用的多肽被不斷酶解出來(lái)導(dǎo)致的。隨著酶解時(shí)長(zhǎng)的繼續(xù)增加，抑菌效果較明顯的下降，酶解時(shí)間在5 h時(shí)抑菌率為37.31%；抑菌效果的衰弱可能是因?yàn)榫哂幸志缘亩嚯姆肿釉陂L(zhǎng)時(shí)間的酶解作用下進(jìn)一步縮短肽鏈，導(dǎo)致原本具備的抗菌性消失[20]。酶解5 h～6 h時(shí)抑菌率變化很小，原因可能是底物蛋白中能夠結(jié)合復(fù)合酶分子的所有酶切位點(diǎn)已被酶解，且有抗菌性的小分子肽不受復(fù)合酶酶解作用，因此抑菌性保持相對(duì)穩(wěn)定。綜上分析，復(fù)合酶解最適時(shí)間為4 h。

2.2.2 復(fù)合酶解溫度對(duì)抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶解時(shí)間4 h；復(fù)合酶解pH3.5。自變量為復(fù)合酶解溫度，試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合酶酶解溫度對(duì)酶解液抑菌率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on antibacterial rate of enzymatic hydrolysate

由圖3可得，在復(fù)合酶酶解溫度從25℃升高到45℃的過(guò)程中，酶解液抑菌率呈現(xiàn)出A型趨勢(shì)，抑菌率最高值出現(xiàn)在35℃時(shí)，為44.19%。酶解溫度從25℃升高至35℃時(shí)抑菌率的上升是因?yàn)閺?fù)合酶活性增強(qiáng)以及分子之間自由碰撞概率上升，兩者共同作用，同時(shí)促進(jìn)了酶促反應(yīng)[21]；而在35℃到45℃區(qū)間內(nèi)抑菌率明顯從44.19%下降到28.23%，分析其原因是復(fù)合酶分子結(jié)構(gòu)遭到熱破壞，致使絕大部分的酶失活，進(jìn)而導(dǎo)致了酶促反應(yīng)的停滯，所以抑菌效果顯著下滑[22]。由此，可以確定35℃是復(fù)合酶的最適酶解時(shí)間。

2.2.3 復(fù)合酶解pH值對(duì)抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶解時(shí)間4 h、溫度35℃；自變量為胃蛋白酶酶解pH值，試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 復(fù)合酶酶解pH值對(duì)酶解液抑菌率的影響Fig.4 Effect of enzyme hydrolysis on the antibacterial rate of enzymatic hydrolysate

由圖4可得，在復(fù)合酶酶解pH值從2.5升高到4.5的過(guò)程中，酶解液抑菌率不斷增長(zhǎng)，抑菌率最高值出現(xiàn)在pH值為4.5時(shí)，為44.24%。在pH值繼續(xù)升高至6.0時(shí)抑菌率迅速下降至21.19%，其原因可能是此時(shí)的pH值迅速遠(yuǎn)離復(fù)合酶中胃蛋白酶的最適酶解pH值，致使胃蛋白酶大量失活，胃蛋白酶主導(dǎo)的酶促反應(yīng)基本停止，此時(shí)復(fù)合酶解過(guò)程中木瓜蛋白酶主導(dǎo)酶促反應(yīng)。而在pH值區(qū)間為6.0～6.5時(shí)，胃蛋白酶基本不進(jìn)行酶促反應(yīng)，且此區(qū)間為木瓜蛋白酶作用的較適值，故而抑菌率變化較不明顯。酶在作用時(shí)，所處的環(huán)境pH值對(duì)酶活影響明顯，為了使酶活達(dá)到較高水平，應(yīng)當(dāng)調(diào)整pH值至該酶最適pH值區(qū)間，加強(qiáng)酶促反應(yīng)中酶分子的結(jié)合能力，最終增強(qiáng)酶解效果[23]。由此，復(fù)合酶的最適酶解pH值確定為4.5。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗(yàn)三因素的設(shè)計(jì)水平，完成對(duì)三因素的設(shè)計(jì)方案，結(jié)合軟件給出的具體組合著手試驗(yàn)操作，記錄數(shù)據(jù)。其設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 4 Response surface design test factors and levels

表5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Response surface design test results

2.3.2 回歸方程建立及方差分析

對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參照軟件，得到三因素對(duì)抑菌率得率的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y=44.22+1.10A+0.26B-0.373 8C+0.002 5AB-0.35AC+0.292 5BC-1.31A2-1.29B2-1.57C2

對(duì)抑菌得率的影響程度大小表現(xiàn)為式中的各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值；單因素的影響方向?yàn)榉匠讨懈飨禂?shù)的正負(fù)號(hào)?；貧w方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance（ANOVA）regression equation

分析表6，模型P＜0.000 1，證明極顯著；失擬項(xiàng)中P=0.176 9＞0.05，F(xiàn) 值為 2.75，表明不顯著；模型的回歸系數(shù) R2=0.993 5，R2Adj=0.985 2，R2Pre=0.926 9。綜上可得，此模型擬合度較高，對(duì)響應(yīng)中的各項(xiàng)變異能夠解釋?zhuān)蚀四Ｐ蛯?duì)小帶魚(yú)復(fù)合酶解條件能夠很好地進(jìn)行預(yù)測(cè)，能夠得出較好的結(jié)果。

PA小于0.000 1，表明這一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平，PB以及PC均小于0.05，表明這兩個(gè)一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平；通過(guò)比較3個(gè)一次項(xiàng)A、B、C的F值大小可得，3個(gè)因素中對(duì)酶解過(guò)程的影響最大的是復(fù)合酶酶解時(shí)間，其次是復(fù)合酶解pH值，影響作用最小的是復(fù)合酶解溫度。此外，在交互項(xiàng)中對(duì)酶解液的抑菌性影響不顯著（P＞0.05）的項(xiàng)是AB，而AC和BC兩項(xiàng)對(duì)酶解液的抑菌性影響顯著（P＜0.05）；所有的二次項(xiàng)（A2、B2、C2）對(duì)酶解液的抑菌性的影響極顯著（P＜0.01）。

圖5所示的三維響應(yīng)面圖可以較直觀的闡明3個(gè)交互項(xiàng)（AB、AC、BC）之間的相互作用[24]。經(jīng)響應(yīng)面分析，得到最佳的小帶魚(yú)復(fù)合酶解條件為復(fù)合酶水解時(shí)間4.2 h、復(fù)合酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶解pH值為4.4。

2.3.3 響應(yīng)面最佳條件驗(yàn)證

圖5 酶解液對(duì)抑菌率的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface analysis of enzymatic hydrolysate to inhibition rate

結(jié)合實(shí)際情況下的試驗(yàn)操作可行性，對(duì)小帶魚(yú)抗菌肽的制備條件進(jìn)行一定程度上的修改，調(diào)整后復(fù)合酶解時(shí)間4.2 h、復(fù)合酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶解pH4.4。最終根據(jù)此條件酶解所得酶解液抑菌率44.48%，與響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果相差0.8%。由此可證，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模型效果良好，優(yōu)化作用真實(shí)有效。對(duì)比胃蛋白酶解得到的小帶魚(yú)酶解液抑菌，抑菌率提高了24.28%，證明利用復(fù)合酶解替代單酶酶解的制備工藝行之有效，能夠獲得更佳的小帶魚(yú)抗菌肽。在最佳酶解條件下測(cè)得酶解液的水解度為32.64%，蛋白質(zhì)含量濃度為0.45 mg/mL。

2.4 Sephadex G-25凝膠層析分離

圖6所示為超濾后的樣品經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析后出現(xiàn)的3個(gè)組分，分別為T(mén)1、T2、T3。同濃度（1.0 mg/mL）[25]下測(cè)定各組分抑菌率，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 Sephadex G-25凝膠層析后各組分抑菌率對(duì)比各組分的抑菌率，選擇T2組分進(jìn)行下一步純化

圖6 酶解液超濾后Sephadex G-25凝膠層析Fig.6 Sephadex G-25 gel chromatography after ultrafiltration of the enzymatic hydrolysis solution

表7 Sephadex G-25凝膠層析后各組分抑菌率Table 7 Antibacterial rate of each component after Sephadex G-25 gel chromatography

2.5 反向高效液相色譜純化

凝膠層析后樣品反向高效液相色譜純化結(jié)果見(jiàn)圖7，反向高效液相色譜純化后各組分抑菌率見(jiàn)表8。

圖7 凝膠層析后樣品反向高效液相色譜純化結(jié)果Fig.7 Purification results of samples after gel chromatography by reversed-phase high performance liquid chromatogra（RP-HPLC）

表8 反向高效液相色譜純化后各組分抑菌率Table 8 Antibacterial rate of each component after RP-HPLC purification

對(duì)圖7及表8分析得出，經(jīng)反向高效液相色譜純化后，只出現(xiàn)了兩個(gè)峰，通過(guò)測(cè)定兩者抑菌率，得出T2-1組分的抑菌率高達(dá)78.56%，相比純化前的小帶魚(yú)酶解原液，抑菌率提高了77.61%，證明純化效果顯著。

3 結(jié)論

本文以舟山小帶魚(yú)為研究對(duì)象，優(yōu)化了小帶魚(yú)抗菌肽制備工藝，同時(shí)探究其抗菌肽的抑菌效果，并對(duì)其純化。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得出的復(fù)合酶制劑組合為胃蛋白酶加木瓜蛋白酶；通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化了小帶魚(yú)抗菌肽的復(fù)合酶解條件，獲得最佳酶解條件：復(fù)合酶解時(shí)間4.2 h、復(fù)合酶酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶酶解pH值為4.4，該條件下實(shí)際測(cè)得小帶魚(yú)復(fù)合酶解液抑菌率為44.87%，相比胃蛋白酶單獨(dú)水解提高了24.28%，表明此復(fù)合酶解效果顯著，能獲得更好抑菌效果的抗菌肽。此時(shí)水解度為32.64%，蛋白質(zhì)含量濃度為0.45 mg/mL。Sephadex G-25凝膠層析分離和反向高效液相色譜純化后抑菌率為78.56%，提升了77.61%，純化效果顯著。該研究結(jié)果對(duì)酶解小帶魚(yú)制備抗菌肽的工藝及深入研究具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究初步探究了小帶魚(yú)抗菌肽的制備及其抑菌效果，而該抗菌肽對(duì)其他代表性菌的抗菌效果以及抗菌機(jī)理未深入討論。在此試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究小帶魚(yú)等低值水產(chǎn)品抗菌肽，將其制成保健食品或在食品保鮮領(lǐng)域加以應(yīng)用，達(dá)到高值化利用低值小帶魚(yú)的目的，帶來(lái)一定的社會(huì)效益以及經(jīng)濟(jì)效益。