響應(yīng)面法優(yōu)化白及多糖酶解工藝及其抗氧化、免疫活性研究

周美，萬科，馬風(fēng)偉，王瑜，李春燕，梁光焰，宋智琴，潘衛(wèi)東，王道平，*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽550014；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽550014；3.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代中藥材研究所，貴州貴陽550006）

據(jù)報道，自由基會引發(fā)多種疾病[1]，如心血管疾病、衰老、癌癥等，抗氧化劑能在一定程度上清除自由基，降低人體衰老的速度，預(yù)防疾??；同樣，免疫力低下會增大細菌病毒對人體的侵襲，嚴(yán)重威脅到人體的健康，免疫調(diào)節(jié)劑能有效調(diào)節(jié)機體免疫功能。因此，亟需開發(fā)出安全、高效的抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑。

白及為蘭科植物白及 Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥塊莖，多年生草本，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、安徽等地。白及中主要含有多糖類、萜類、菲類、聯(lián)芐類等化學(xué)成分[2-3]。植物多糖具有較好的生物學(xué)活性，能有效清除自由基，促進機體健康、益壽延年[4-5]；同時也具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，能提高巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體生成[6]；提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和NK細胞的活性，增強機體抵抗力[7]。白及多糖是白及的主要活性成分，具有安全、毒副作用小等優(yōu)點，是一種值得深入研究的天然活性物質(zhì)。酶解法提取植物多糖是一種新興的提取方法，由于其提取效率高、便捷、節(jié)省能源，目前被廣泛使用。白及藥用部位為塊莖，果膠是其細胞壁的主要成分之一，果膠酶能對其細胞壁進行降解，多糖類成分能更有效溶出，多糖提取率增加。本試驗運用響應(yīng)面法對白及多糖的酶解工藝進行優(yōu)化，并對白及多糖的抗氧化活性、免疫活性進行系統(tǒng)考察，以期為相關(guān)食品和醫(yī)藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白及：貴州省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：日本株式會社公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、小鼠TNF-α、酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：美國 Sigma公司；小鼠巨噬細胞系RAW264.7：上海細胞庫；脂多糖、二甲基亞砜、磷酸氫二鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、水楊酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純；維生素C、D-無水葡萄糖：中國食品藥品檢定研究院；果膠酶（5000 U/g）：伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPECTRA max PLUS 384光吸收酶標(biāo)儀：美國分子儀器公司 Molecular Devices；HP-8453紫外可見分光光度計：美國HP公司；AG285型十萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SB-2000型水浴鍋：上海愛朗儀器有限公司；HC-2066型高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；密理博明澈TM-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)：德國默克公司；酶聯(lián)免疫檢測儀、水套式CO2培養(yǎng)箱：美國熱電公司；倒置顯微鏡：日本尼康公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白及多糖酶解試驗方法與設(shè)計

1.3.1.1 單因素試驗

通過前期白及多糖提取方式對比發(fā)現(xiàn)，果膠酶酶解優(yōu)于煎煮，因此，提取方式選擇果膠酶酶解。多糖提取率按硫酸-苯酚法檢測[8]。在液料比設(shè)定為100∶1（mL/g）的條件下，依次考察酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH值影響白及多糖提取率的程度。以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得多糖提取液分別按硫酸-苯酚法計算提取率。

1）酶添加量的考察

固定其他提取條件，以酶添加量為單因素變量，分別考察酶添加量為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%對白及多糖提取率的影響。

2）酶解溫度的考察

固定其他提取條件，以酶解溫度為單因素變量，分別考察酶解溫度為 40、45、50、55、60、65 ℃對白及多糖提取率的影響。

3）酶解時間的考察

固定其他提取條件，以酶解時間為單因素變量，分別考察酶解時間為 55、70、85、100、115 min 對白及多糖提取率的影響。

4）pH值的考察

固定其他提取條件，以pH值為單因素變量，分別考察 pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 對提取率的影響。

1.3.1.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過對單因素的系統(tǒng)考察，以酶添加量（A）、pH值（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，以白及多糖提取率為響應(yīng)值。運用Design Expert V8.0.6軟件進行四因素三水平試驗設(shè)計，白及多糖的提取工藝因素水平表見表1。

表1 白及多糖的提取工藝因素水平表Table 1 The factor level table of extraction technology of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.polysaccharides

1.3.2 白及多糖的抗氧化活性試驗

精密稱取白及多糖適量，置10 mL容量瓶中，用純水溶解、定容，再稀釋為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL不同濃度的溶液。VC對照品溶液的制備：精密稱取VC對照品適量，置10 mL容量瓶中，用純水溶解、定容，再稀釋為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的對照品溶液。

1.3.2.1 DPPH·清除能力的測定

在15 mL具塞試管中分別加入2 mL不同濃度供試液，分別加入1 mL純水、2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合均勻后，于25℃條件下避光反應(yīng)40 min，在517 nm處測吸光度值（Am）。在同等條件下，以2 mL蒸餾水代替DPPH溶液，測得吸光度值為（A1）；以2 mL純水代替供試液，測得吸光度值為（A0）；陽性對照為VC。計算公式如下[10]：

DPPH 自由基清除力/%=[A0－（Am－A1）]/A0×100

1.3.2.2 ·OH清除能力的測定

在15 mL具塞試管中分別加入1 mL不同濃度供試液，再分別加入8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、8 mmol/L雙氧水溶液、蒸餾水、10 mmol/L水楊酸、無水乙醇各1 mL，混合均勻后，于37℃條件下水浴30 min。于510 nm處測定吸光度值（Am）。在同等條件下，以1 mL蒸餾水代替水楊酸溶液，測得吸光度值為（A1）；以1 mL蒸餾水代替樣品液，測得吸光度值為（A0）；陽性對照為VC。清除率公式如下[11]：

·OH 自由基清除力/%=[A0－（Am－A1）]/A0×100

1.3.2.3 ABTS+·清除能力的測定

精密稱取ABTS+·和K2S2O7適量置同一個1000mL的容量瓶中，加無水乙醇配制成濃度為7 mmol/L ABTS+·和2.45 mmol/L K2S2O7混合溶液，放置過夜，即得ABTS+·儲備液。臨用時用無水乙醇將儲備液稀釋成在734 nm處吸光度值為（0.70±0.05）的溶液。分別取2 mL各濃度供試液和2 mL ABTS+·溶液充分混合并放置20 min，于734 nm處測吸光度值A(chǔ)Sample，在相同條件下，2 mL ABTS+·溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度值為AControl。陽性對照為VC。清除率公式如下[12-13]：

ABTS+自由基清除力/%=[（AControl－ASample）/AControl]×100

1.3.3 白及多糖的免疫活性

1.3.3.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)

精密稱取白及多糖適量，置25 mL容量瓶中，用純水溶解、定容，再稀釋成 25、100、400 μg/mL 3 個濃度供試液；試驗組為不同濃度白及多糖組；空白組為DMEM 培養(yǎng)基組（BC）；對照組為 1 μg/mL LPS組（PC）。

RAW264.7細胞，加入10%胎牛血清、1 mL胰酶（0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA）的90%DMEM培養(yǎng)基，37℃條下在CO2的細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.3.2 MTT法檢測各濃度白及多糖對細胞存活率的影響

采用MTT法[14]測定細胞存活率。選取對數(shù)生長期RAW 264.7 細胞，按 1×106個/mL、100 μL/孔接種于96孔板中，37℃條下在CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，棄去上清，加入不同濃度白及多糖溶液各100 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清，每孔加入MTT溶液100 μL，繼續(xù)孵育3 h，然后每孔加入MTT終止液100 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)20 h，在550 nm處測定OD值，重復(fù)試驗3次，計算細胞的相對存活率。

相對細胞存活率/%=（ASample-ABlank）/（AControl-ABlank）×100

式中：ASample為試驗組吸光值；ABlank為空白組吸光值；AControl為空白組吸光值

1.3.3.3 白及多糖誘導(dǎo)RAW264.7細胞活化釋放免疫因子TNF-α

將密度為1×106個/mL細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，37℃條下在CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去上清，分別加入100 μL不同濃度供試液、純水、LPS溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按ELISA檢測試劑盒操作方法對TNF-α進行定量測定，求出細胞因子TNF-α的分泌量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值。采用Design Expert V8.0.6以及SPSS22.0等軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

酶添加量對白及多糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶添加量對白及多糖提取率的影響Fig.1 The effect of enzyme addition on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如圖1所示，白及多糖提取率整體上與酶添加量呈正相關(guān)，但在酶添加量為1.2%以后白及多糖提取率上升緩慢，造成這種現(xiàn)象的原因是隨著酶的不斷加入會使更多的底物在同一時間被分解得更充分，但當(dāng)超過底物的接納程度后便達到飽和，此時再添加多余的酶對提取的影響并不明顯。所以酶添加量定為1.2%。

酶解溫度對白及多糖提取率的影響見圖2。

如圖2所示，白及多糖提取率隨溫度升高有先上升后緩慢下降趨勢，55℃時提取率最大，這是由于酶發(fā)揮其活性需要一個最適溫度，當(dāng)超過此溫度后，酶結(jié)構(gòu)會慢慢變性等，從而使酶解程度降低，所以選擇55℃為酶解溫度。

酶解時間對白及多糖提取率的影響見圖3。

圖2 酶解溫度對白及多糖提取率的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

圖3 酶解時間對白及多糖提取率的影響Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如圖3所示，白及多糖提取率隨酶解時間延長而呈上升趨勢，在85 min以后增加緩慢，可能是因為細胞壁被充分分解后，胞內(nèi)物質(zhì)的溶出便趨于穩(wěn)定，而多糖得率的微弱降低可能是酶對多糖分子產(chǎn)生了輕微的降解，因此酶解時間選擇85 min。

pH值對白及多糖提取率的影響見圖4。

圖4 pH值對白及多糖提取率的影響Fig.4 The effect of pH on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

如圖4所示，白及多糖提取率隨pH值增大呈先上升后降低的趨勢，pH5.5時提取率最高，表明酶的活性存在一個最佳的pH值，越接近此值，酶的活性越高，所以選擇pH5.5。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面-星點設(shè)計法優(yōu)化白及多糖提取率的試驗結(jié)果見表2和表3。其中表2為星點設(shè)計試驗和結(jié)果；表3為多糖優(yōu)化工藝所建立的回歸方程的方差分析。

表2 響應(yīng)面設(shè)計試驗與結(jié)果Table 2 The central composite design and test results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression equation

通過多元線性回歸二項式擬合，得方程為Y=+59.50+2.99A-0.11B-4.83C+0.17D-1.80AB+2.83AC+1.35AD+0.35BC+2.16BD+1.32CD-4.36A2-7.34B2-13.69C2-3.89D2，方程R2=0.920 3，說明該模型能夠較好地預(yù)測白及多糖的酶解工藝。軟件預(yù)測最佳提取條件為：酶添加量為1.40%、溫度為54.71℃、pH值為5.43、時間為87.54 min，白及多糖多糖提取率預(yù)測值為58.29%。

方差分析結(jié)果表明，方程模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項15.64＞0.05，不顯著，說明建立的模型能很好地預(yù)測白及多糖提取率，實際試驗與預(yù)測值差異較小，擬合程度好。一次項A、二次項D2顯著，二次項C2極顯著，一次項C和二次項A2、B2高度顯著。從F值可知，各因素對多糖提取的影響程度為：酶解溫度＞酶添加量＞pH值＞酶解時間。

2.3 響應(yīng)面分析

各因素對白及多糖提取率的交互作用結(jié)果見圖5。

由圖5b、5c和5f可知，曲面彎曲程度較大，說明酶解溫度、酶添加量、pH值的交互作用對白及多糖提取率的影響較大。

2.4 驗證試驗

基于響應(yīng)面法優(yōu)選的白及多糖最佳酶解工藝，結(jié)合實施的便利，將優(yōu)化條件修正為酶添加量為1.4%，溫度為54.7℃，時間為87.5 min，pH值為5.4，試驗重復(fù)5次，得到白及多糖提取率平均值為58.32%，和預(yù)測值非常接近。

圖5 兩因素的交互作用對白及多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.production

2.5 抗氧化試驗結(jié)果

白及多糖DPPH自由基清除率見圖6。

圖6 白及多糖DPPH自由基清除率Fig.6 The effect of scavenging DPPH free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由圖6可知，白及多糖對DPPH自由基有一定的清除作用，在檢測濃度范圍內(nèi)，隨著供試液濃度的增加清除率逐漸增強，在濃度為3.2 mg/mL時，其DPPH·清除率高達43.6%。

白及多糖·OH清除率見圖7。

圖7 白及多糖·OH清除率Fig.7 The effect of scavenging hydroxyl free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由圖7可知，白及多糖對·OH有一定的清除作用，在檢測濃度范圍內(nèi)，隨著供試液濃度的增加清除率逐漸增強，在1.6 mg/mL后清除率增加緩慢，在濃度為3.2 mg/mL時，其OH自由基清除率高達74.8%。

白及多糖ABTS+·清除率見圖8。

圖8 白及多糖ABTS+·清除率Fig.8 The effect of scavenging ABTS+free radicals on the polysaccharides extraction rate of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.

由圖8可知，白及多糖對ABTS+自由基有一定的清除作用，在檢測濃度范圍內(nèi)，隨著供試液濃度的增加清除率逐漸增強，在1.6 mg/mL后清除率增加緩慢，在濃度為3.2 mg/mL時，其ABTS+自由基清除率高達51.7%。

2.6 不同濃度白及多糖的體外免疫誘導(dǎo)活性結(jié)果

不同濃度白及多糖對RAW 264.7細胞的存活率影響見圖9。

圖9 不同濃度白及多糖對RAW 264.7細胞的存活率影響Fig.9 The effects of different concentrations of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.on RAW 264.7 cells

由圖9可知，在所測定的濃度范圍內(nèi)，不同濃度供試液對細胞的生長具有一定的促進作用，細胞存活率均高于100%。

不同濃度白及多糖誘導(dǎo)RAW 264.7細胞分泌TNF-α的水平見圖10。

不同濃度供試液分別孵育 24、36、48 h后誘導(dǎo)RAW264.7細胞活化分泌TNF-α的結(jié)果。在所測定的濃度范圍內(nèi)，不同時間段的酶解產(chǎn)物能顯著誘導(dǎo)RAW264.7細胞活化分泌TNF-α。白及多糖濃度為400 μg/mL誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌TNF-α的作用最強。

圖10 不同濃度白及多糖誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌TNF-α的水平Fig.10 Different concentrations of Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.induced TNF-α secretion in RAW 264.7 cells

3 結(jié)論

本試驗在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化白及多糖酶解工藝，方差分析結(jié)果表明，影響白及多糖提取率的因素主次順序為：酶解溫度＞酶添加量＞pH值＞酶解時間。最佳提取條件為：酶添加量為1.4%、溫度為54.7℃、pH值為5.4、時間為87.5 min，白及多糖提取率預(yù)測值為58.32%。不同模型抗氧化活性試驗結(jié)果表明，白及多糖具有較好的抗氧化活性。體外免疫誘導(dǎo)活性結(jié)果表明，不同濃度白及多糖對Raw264.7細胞生長有一定的促進作用，而且均可對Raw264.7細胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性，其中濃度為400 μg/mL時免疫誘導(dǎo)活性效果顯著。本研究為白及多糖的深度開發(fā)利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。