適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉的致敏性評價

石佳琪，李想，賈曉江，朱宏，王世杰，3，王碩，*

（1.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室，天津300350；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司河北省乳制品研發(fā)與安全控制重點實驗室，河北石家莊050221；3.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

牛奶是生命早期攝入的最基本且重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，富含滿足新生兒生長發(fā)育所需的多種營養(yǎng)成分，逐漸成為母乳的替代品。但是，由于腸道屏障和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，嬰兒易對牛奶中一種或多種蛋白質(zhì)產(chǎn)生牛奶過敏反應(yīng)（cow's milk allergy，CMA）[1]。

CMA是兒童早期最常見的食物過敏之一，發(fā)病率在2%到3%之間[2]，此類過敏反應(yīng)的主要癥狀有輕微皮膚瘙癢、蕁麻疹、鼻結(jié)膜炎、哮喘、嘔吐、腹瀉，甚至全身過敏性休克和死亡[3]。CMA最常出現(xiàn)在嬰兒期和幼兒期，通常是出生后前12個月，并有隨著年齡增長而減弱或消失的趨勢[4]。盡管人們?nèi)找嬲J識到牛奶過敏是一個嚴重的健康問題，但由于缺乏有效的治療方法，對食物過敏的治療主要依賴于避免過敏原接觸，以防止過敏個體因食物引起的不良反應(yīng)[5]，但這可能會帶來與生長不足，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和心血管健康相關(guān)的潛在營養(yǎng)不良影響[6]。

牛奶中含有20多種引起過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)，其中乳清蛋白和酪蛋白為主要過敏原[7]。目前，通過酶解法破壞牛奶蛋白抗原表位是減弱其致敏性的有效方式之一[8]。因此，建議高危嬰兒或被診斷出對牛奶過敏的嬰兒選擇由牛奶水解物制成的低過敏原配方奶粉[9]。盡管母乳幾乎是所有嬰兒的最佳營養(yǎng)來源，但相比于純母乳喂養(yǎng)，適度水解乳清蛋白配方奶粉和深度水解乳清蛋白或酪蛋白配方奶粉均可防止過敏性疾病高發(fā)嬰兒過敏[10]。此外，在嬰兒出生后的前4個月，將水解配方奶粉而非傳統(tǒng)配方奶粉作為母乳補充或替代品，可降低嬰兒出生后第一年患過敏的風(fēng)險[11]。因此，當易過敏兒童無法進行母乳喂養(yǎng)時，水解牛乳蛋白奶粉是預(yù)防牛奶過敏臨床癥狀發(fā)展的最佳選擇[12]。

本文以乳清蛋白濃縮物為陽性對照，采用BALB/c小鼠建立過敏模型，通過觀察過敏癥狀，計算脾臟系數(shù)，測定血清中總免疫球蛋白E（IgE）及組胺含量，對前期研制的適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉進行致敏性評價，并與普通脫脂奶粉和深度水解乳清蛋白粉作比較，旨為后續(xù)低致敏奶粉的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

4周齡SPF級雌性BALB/c小鼠：維通利華實驗動物中心。南開大學(xué)SPF級實驗動物中心提供足量無牛奶蛋白維持鼠糧及清潔飲用水，相對濕度50%～55%，平均溫度（23±2）℃，光照周期為12 h。

適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉（partially hydrolyzed whey formula，pHWF）：實驗室研發(fā)，含低聚半乳糖8.5 mg/g、低聚果糖4 mg/g及多聚果糖5 mg/g；深度水解乳清蛋白粉（whey protein hydrolysate，WPH）、80%乳清蛋白濃縮物（80%whey protein，WPC80）及普通脫脂奶粉（skimmed milk powder，SMP）：市售。

霍亂毒素（CT）：Sigma-Aldrich；小鼠血清IgE檢測試劑盒、小鼠血清組胺檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機（ST16R）：賽默飛世爾科技有限公司；酶標儀（InfiniteR200 PRO NanoQuant）：瑞士帝肯；電子天平（QUINTIX124-1CN）：德國賽多利斯；旋渦混合器（VORTEX-5）：其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計

將60只BALB/c小鼠分成6組（n=10），分別為空白組、CT組、80%乳清蛋白濃縮物（WPC80）組、適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉（pHWF）組、深度水解乳清蛋白粉（WPH）組及普通脫脂奶粉組（SMP）。其中WPC80組為陽性對照組，空白組不做任何處理，CT組僅灌胃霍亂弧菌毒素（CT）10 μg/只。致敏周期為6周，每周1次。實驗組前5次灌胃致敏劑量為20 mg/只，并輔以霍亂弧菌毒素（CT）10 μg/只，以防小鼠產(chǎn)生免疫耐受，最后一次灌胃致敏劑量為50 mg/只。各組以超純水為溶劑，灌胃體積為0.3 mL。最后一次灌胃前稱量各組小鼠體重，并在灌胃后1 h，對各組小鼠進行過敏癥狀評分。處死小鼠，收集血液儲存于-80℃冰箱，摘取脾臟并稱量重量，計算脾臟系數(shù)，公式[13]如下：

脾臟系數(shù)/%=脾重/體重×100

1.3.2 血清總IgE及組胺含量的測定

血液在室溫25℃中靜置2 h后置于低溫冷凍離心機中以4 000 r/min，離心15 min，小心吸取上清液，儲存于-80℃冰箱。若在保存過程中出現(xiàn)沉淀，需在使用前再次離心。使用商業(yè)化酶聯(lián)免疫試劑盒測定血清中總IgE和組胺的含量。

1.3.3 過敏癥狀評分

過敏癥狀出現(xiàn)在灌胃后15 min～30 min，并在第一癥狀出現(xiàn)后40 min～50 min達到峰值。采用Li等[14]的評分標準系統(tǒng)評價小鼠過敏癥狀：0=無癥狀；1=在鼻子和頭部周圍劃傷和摩擦；2=眼睛和嘴周圍浮腫，毛發(fā)豎起，活動減少和/或活動減少伴隨呼吸急促；3=喘息、呼吸急促和嘴和尾巴周圍的發(fā)紺；4=在刺激、震顫和抽搐后沒有活動；5=死亡。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均使用GraphPad Prism 5軟件作圖，并在SPSS軟件進行差異顯著性分析。采用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異顯著性，P＜0.05表示具有差異顯著性，P＜0.01表示具有極顯著性差異，P＞0.05則無顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠過敏癥狀評分

不同樣品對小鼠過敏癥狀的影響見圖1。

如圖1所示，WPC80組的過敏癥狀評分最高，SMP組過敏癥狀評分較低，空白組、CT組、pHWF組和WPH組的過敏癥狀評分均為0，說明乳清蛋白濃縮物致敏作用最強，導(dǎo)致該組小鼠過敏情況較嚴重，普通脫脂奶粉組小鼠輕微過敏，而適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉組和深度水解乳清蛋白粉組并無過敏癥狀。

2.2 小鼠的體重變化

不同樣品對小鼠體重的影響見圖2。

圖1 過敏癥狀評分Fig.1 Anaphylactic symptom scores

圖2 小鼠的體重變化Fig.2 Body weight changes of mice

分別在每次灌胃前稱量小鼠體重，計算平均數(shù)。如圖2所示，空白組、CT組及pHWF組小鼠體重隨時間穩(wěn)定上升，而WPC80組小鼠體重在第4次灌胃后出現(xiàn)下降趨勢，SMP組小鼠體重在第5次灌胃后也開始下降，這可能是由于乳清蛋白導(dǎo)致小鼠過敏使其體重減輕。段翠翠等[15]在進行不同乳源蛋白致敏性研究時，也出現(xiàn)了由于β乳球蛋白導(dǎo)致小鼠致敏而體重下降的現(xiàn)象，與本文結(jié)果一致。WPH組小鼠體重在第4次灌胃后也出現(xiàn)下降，可能是蛋白被深度水解導(dǎo)致營養(yǎng)不良而影響其體重增加。各組間體重?zé)o顯著差異性。

2.3 小鼠的脾臟系數(shù)

不同樣品對小鼠脾臟系數(shù)的影響見圖3。

圖3 小鼠脾臟系數(shù)Fig.3 The spleen index of mice

脾臟是機體最大的免疫器官，也是機體產(chǎn)生抗原特異性T細胞反應(yīng)和B細胞產(chǎn)生抗體的重要組織之一。脾臟系數(shù)能在一定程度上反應(yīng)機體免疫功能[16]。如圖3所示，WPC80組和SMP組脾臟系數(shù)顯著增加（P＜0.05），pHWF組和WPH組脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），與空白組無顯著差異（P＞0.05），這說明乳清蛋白可通過損傷免疫器官來破壞宿主全身免疫功能，而乳清蛋白被不同程度水解后可顯著減輕此損傷?；魜y毒素是一種食物過敏研究中常用的免疫佐劑，可增強機體免疫應(yīng)答反應(yīng)以防止產(chǎn)生免疫耐受，這可能是CT組脾臟系數(shù)顯著增加的原因之一。

2.4 小鼠血清中總IgE含量

不同樣品對小鼠血清中總IgE含量的影響見圖4。

圖4 小鼠血清中總IgE含量Fig.4 Total IgE content in serum of mice

血清總IgE水平是過敏反應(yīng)的標志物之一，與兒童過敏癥狀明顯相關(guān)[17]。如圖4所示，WPC80組血清中總IgE水平顯著高于空白組、CT組、pHWF組及WPH組（P＜0.01），但與SMP組之間的差異不顯著（P＞0.05）。SMP組血清中總IgE水平顯著高于空白組、CT組、pHWF組（P＜0.05），但與WPH組之間的差異不顯著（P＞0.05）?？瞻捉M、CT組、pHWF組及WPH 組之間血清中總IgE水平的無顯著差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明：乳清蛋白作為牛奶蛋白中的重要過敏原，可顯著提高過敏小鼠血清中總IgE的含量，進而強烈刺激IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)的發(fā)生，而乳清蛋白被適度水解后可顯著減弱其對IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)的刺激。

2.5 小鼠血清中組胺含量

不同樣品對小鼠血清中組胺含量的影響見圖5。

圖5 小鼠血清中組胺含量Fig.5 Histamine content in serum of mice

在過敏反應(yīng)期間，肥大細胞脫顆粒后釋放的組胺是I型過敏反應(yīng)急性期中特征最明確，最有效的血管活性介質(zhì)[18]。如圖5所示，WPC80組血清中組胺水平顯著高于pHWF組（P＜0.01）、空白組、CT組及WPH組（P＜0.05），但與SMP組之間的差異不顯著（P＞0.05）。SMP組血清中組胺水平顯著高于pHWF組（P＜0.05），但與空白組、CT組及WPH組之間的差異不顯著（P＞0.05）?？瞻捉M、CT組、pHWF組及WPH組之間血清中組胺水平不存在差異顯著性（P＞0.05）。以上結(jié)果說明乳清蛋白濃縮物對小鼠肥大細胞的刺激作用最強，普通脫脂奶粉的刺激作用次之，而深度水解乳清蛋白粉和適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉的刺激作用較弱。

綜上，乳清蛋白濃縮物組小鼠過敏情況最嚴重，其次是普通脫脂奶粉組。深度水解乳清蛋白粉組和適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉組小鼠均無過敏癥狀。相較于普通脫脂奶粉，適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉破壞部分乳清蛋白抗原表位，有效減弱乳清蛋白的致敏性。深度水解乳清蛋白粉組血清中總IgE和組胺含量略高于適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉組，但無顯著性差異，可能是適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉添加了低聚果糖和低聚半乳糖等益生元可減弱過敏反應(yīng)，降低血清中總IgE含量和組胺水平[19-20]。因此，適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉降低了牛奶過敏反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險。

3 結(jié)論

本研究成功建立以乳清蛋白為致敏原的過敏模型，該組小鼠表現(xiàn)出嚴重的過敏癥狀，伴隨脾臟受損，血清中總IgE含量升高，肥大細胞脫顆粒釋放組胺增多，激發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)。適度水解乳清蛋白嬰兒可有效減弱乳清蛋白致敏性，抑制IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)的發(fā)生。因此，建議不能完全進行母乳喂養(yǎng)或患有過敏性疾病遺傳風(fēng)險的嬰兒選擇適度水解乳清蛋白嬰兒配方奶粉，以避免發(fā)生牛奶過敏反應(yīng)。