晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗的研究

董璐，吳玥琨，吳亞敬，張燕

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最豐富且功能多樣的生物大分子。蛋白質(zhì)的獨(dú)特構(gòu)象決定了它的功能特性，這種構(gòu)象可以被體內(nèi)多種化學(xué)途徑所干擾，造成蛋白質(zhì)損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體病變[1-3]。非酶促糖化，也稱為美拉德反應(yīng)，是蛋白質(zhì)損傷的途徑之一[4]。反應(yīng)過程中活性羰基化合物與蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)結(jié)合，導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)共價(jià)損傷，并形成內(nèi)源性晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），這被認(rèn)為與許多人類疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，如糖尿病及其并發(fā)癥，動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等[5-10]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，體內(nèi)AGEs水平升高是1型糖尿病[11]、β細(xì)胞損傷[12-15]及外周胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[16-17]的重要危險(xiǎn)因素，此發(fā)現(xiàn)引起了研究人員追溯AGEs水平升高的根源的興趣。有科學(xué)家認(rèn)為在高度工業(yè)化的現(xiàn)代飲食環(huán)境中富含豐富的AGEs及其前體物質(zhì)可能解釋此現(xiàn)象[18]。

食物中外源性AGEs主要是由醛類化合物結(jié)合胺或酰胺通過美拉德反應(yīng)形成，但是由于食品基質(zhì)及美拉德反應(yīng)的復(fù)雜性，導(dǎo)致AGEs前體物較多，與內(nèi)源性AGEs相比，形成的AGEs具有極強(qiáng)的異質(zhì)性[19]?，F(xiàn)代飲食中充滿了熱處理食物，這些食物有助于增加機(jī)體AGEs的攝入[20]。據(jù)估計(jì)，人們每天可以通過牛奶和烘焙產(chǎn)品膳食攝入AGEs量為25 mg/d至75 mg/d[21]。已有研究顯示，膳食AGEs攝入量與血漿游離AGEs相關(guān)[22]。雖然外源性AGEs和內(nèi)源性AGEs被認(rèn)為是兩個(gè)獨(dú)立的來源，但最近觀察到它們可能協(xié)同作用并導(dǎo)致總體糖毒素負(fù)擔(dān)，這可能增加AGEs對(duì)健康的危害影響[20]。Borg等[23]以AIN-93飼料作為低劑量AGEs組，高溫加熱（165℃）烘焙的AIN-93飼料作為高劑量AGEs組，研究膳食攝入AGEs對(duì)胰島β細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明高劑量膳食攝入AGEs會(huì)對(duì)胰島β細(xì)胞造成損傷。但是由于飼料基質(zhì)組成復(fù)雜，高溫加熱不僅增加AGEs的含量，同時(shí)也增加飼料中其它有害物的含量，如糖氧化產(chǎn)物，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，α-二羰基化合物等，均可在體內(nèi)引起機(jī)體AGEs的生成[24]，所以不能完全證明AGEs的作用。Li等[25-26]分別研究野生型大鼠和高脂飲食喂養(yǎng)大鼠暴露于游離態(tài)Nε-羧甲基賴氨酸后對(duì)大鼠機(jī)體的損傷，結(jié)果表明游離態(tài)Nε-羧甲基賴氨酸可對(duì)大鼠腎臟造成損傷。但目前還鮮少有關(guān)于膳食攝入蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs對(duì)機(jī)體損傷的報(bào)道，所以填補(bǔ)此研究空白是十分必要的。

本研究以丙酮醛修飾β-乳球蛋白產(chǎn)物（methylglyoxal modified β-lactoglobulin product，MG-bLG）為蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs的代表物，通過灌胃攝入方式測(cè)定AGEs對(duì)昆明（KM）小鼠體重、攝食量、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、血脂、血清中AGEs水平及IR相關(guān)指標(biāo)的影響，來研究蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs對(duì)機(jī)體IR的促進(jìn)作用，以期為蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs誘導(dǎo)機(jī)體IR提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；Accu-Chek羅氏活力血糖儀、Accu-Chek羅氏活力血糖試紙：德國羅氏診斷公司；冷凍離心機(jī)Microfuge 20R：美國貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

昆明小鼠（KM，雄性、6周齡）：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXX（京）2016-0006，合格證No.11400700294047，于天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境達(dá)到凈化級(jí)別。大小鼠維持飼料：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，組成成分：粗蛋白≥180 g，粗脂肪≥40 g，粗纖維≤50 g，水分≤100 g。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MG-bLG的制備

配置MG與bLG的反應(yīng)溶液，使MG和bLG在0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的終濃度分別達(dá)到2 mmol/L和1.8 mg/mL。將反應(yīng)溶液在100℃下孵育1 h，待反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行超濾以除去未反應(yīng)的MG。將溶有MG修飾的bLG產(chǎn)物（MG-bLG）的溶液冷凍干燥得到MG-bLG粉末。將MG-bLG重溶于0.9%生理鹽水中，至終濃度為2 mg/mL用于實(shí)驗(yàn)灌胃所用。

1.3.2 動(dòng)物飼養(yǎng)

在金融全面去杠桿的大政策背景之下，無論是機(jī)構(gòu)信貸還是個(gè)人信貸都將面臨收緊。通過對(duì)現(xiàn)金貸更嚴(yán)格的監(jiān)管，個(gè)人杠桿率，尤其是信用較差個(gè)人的杠桿率，將有一定程度的降低。通過對(duì)現(xiàn)金貸平臺(tái)自身杠桿率的控制，現(xiàn)金貸行業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)將進(jìn)一步被抑制。通知規(guī)定，小貸公司通過信貸資產(chǎn)轉(zhuǎn)讓、ABS方式獲得的資金也要進(jìn)入杠桿率計(jì)算，杜絕了現(xiàn)金貸平臺(tái)表外融資，進(jìn)一步降低了現(xiàn)金貸行業(yè)的整體杠桿率。

雄性6周齡SPF級(jí)KM小鼠30只，進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組[C組，體重（36.1±1.3）g]，實(shí)驗(yàn)組[MG-bLG 組，體重（35.8±1.7）g]。C 組每天灌胃與MG-bLG組體積相同的0.9%生理鹽水，MG-bLG組每天灌胃0.2 mL MG-bLG（2 mg/mL，溶于0.9%生理鹽水），連續(xù)灌胃6周。飼養(yǎng)條件：每籠5只小鼠，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜交替光照，自由攝食飲水，喂養(yǎng)6周后停止喂養(yǎng)。

1.3.3 血清樣本收集及保存

喂養(yǎng)結(jié)束后，小鼠禁食12 h后，眼球取血，全血4℃條件下4 000 r/min離心15 min，分離獲得血清，分裝后于-80℃冰箱保存。

1.3.4 FBG值的測(cè)定

動(dòng)物喂養(yǎng)過程中，每周測(cè)定一次小鼠空腹血糖值。測(cè)定之前小鼠斷糧12±0.5 h，采用尾靜脈取血方式測(cè)定小鼠血糖值作為空腹血糖值。實(shí)驗(yàn)開展前測(cè)定1次空腹血糖作為0點(diǎn)空腹血糖值。

1.3.5 FINS水平測(cè)定

FINS水平使用小鼠胰島素ELISA試劑盒測(cè)定，測(cè)定方法按照說明書操作。

1.3.6 血清中血脂含量測(cè)定

分別測(cè)定血清中LDL-C、HDL-C、T-CHO和TG含量，測(cè)定方法按照相應(yīng)測(cè)試盒說明書操作。

1.3.7 IR相關(guān)指數(shù)分析

采用homeostasis model assessment（HOMA）穩(wěn)態(tài)模型[27]評(píng)價(jià) IR 水平（HMOA-IR）、胰島素敏感性（insulin sensitivity，IS）水平（HOMA-IS）及胰島β細(xì)胞功能（HOMA-β）。計(jì)算公式如下：

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

HOMA-IS=22.5/（FBG×FINS）

HOMA-β=20×FINS/（FBG-3.5）

式中：FBG為空腹血糖值，mmol/L；FINS為空腹胰島素值，mU/L；22.5/20/3.5為各公式常量系數(shù)。

1.3.8 血清中AGEs含量

采用ELISA測(cè)定小鼠血清中AGEs含量，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 24進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MG-bLG對(duì)小鼠體重和攝食量的影響

MG-bLG對(duì)小鼠體重和攝食量的影響如表1所示。

在灌胃MG-bLG前（0周），MG-bLG組小鼠體重與C組小鼠體重相比，不具有顯著性差異。經(jīng)2周的灌胃干預(yù)，MG-bLG組小鼠體重與C組小鼠體重比較出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），灌胃持續(xù)至 6周，MG-bLG組小鼠的體重較于C組分別增加4.03%、4.79%、6.84%、8.55%和9.77%。在實(shí)驗(yàn)過程中，MG-bLG組小鼠的攝食量高于C組，說明MG-bLG組小鼠的體重重于C組小鼠的體重可能是由攝食量的不同而引起。此結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果相一致，AGEs有刺激食欲的功能，可以造成機(jī)體營養(yǎng)過剩[28]。

表1 MG-bLG對(duì)小鼠體重及攝食量的影響Table 1 The effect of MG-bLG on body weight and food intake in mice

2.2 MG-bLG對(duì)小鼠血脂的影響

在2型糖尿病和IR的研究中發(fā)現(xiàn)，個(gè)體除了表現(xiàn)為糖代謝異常外，還會(huì)發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象[29]。MG-bLG對(duì)小鼠血脂的影響如表2所示。

表2 MG-bLG對(duì)小鼠血清血脂的影響Table 2 The effect of MG-bLG on serum lipids in mice

由表2可知，經(jīng)長時(shí)間攝入MG-bLG，MG-bLG組小鼠 LDL-C、TG、T-CHO 水平分別為 0.31、1.10、2.60 mmol/L，顯著的高于 C 組（P＜0.05），HDL-C 水平無顯著變化。說明長期攝入MG-bLG引起小鼠脂質(zhì)代謝變化。

2.3 MG-bLG對(duì)小鼠血糖的影響

MG-bLG對(duì)小鼠血糖的影響如圖1所示。

由圖1可知，MG-bLG組小鼠0～6周FPG平均值分別為 5.2、5.1、6.4、6.8、7.0、7.1、7.1 mmol/L，隨著灌胃時(shí)間的延長，F(xiàn)PG值增大。經(jīng)灌胃MG-bLG 3周后，MG-bLG組小鼠的FPG水平顯著高于C組（P＜0.05）。膳食干預(yù)4周后，MG-bLG組小鼠FPG值均在7.0mmol/L以上。說明長時(shí)間攝入MG-bLG可增高小鼠的FPG水平。

圖1 MG-bLG對(duì)小鼠FBG的影響Fig.1 The effect of MG-bLG on FBG in mice

2.4 MG-bLG對(duì)小鼠FINS的影響

MG-bLG對(duì)小鼠FINS的影響如圖2所示。

圖2 MG-bLG對(duì)小鼠FINS的影響Fig.2 The effect of MG-bLG on fasting insulin in mice

經(jīng)灌胃6周MG-bLG后，MG-bLG組小鼠FINS水平為14.8 mU/L，顯著高于（P<0.05）C組小鼠的FINS水平（12.5 mU/L）。血糖濃度升高可刺激胰島β細(xì)胞增加胰島素合成及分泌，以維持機(jī)體血糖平衡，而MG-bLG組FINS水平顯著高于C組，說明MG-bLG可促進(jìn)小鼠血糖水平升高，促進(jìn)機(jī)體合成分泌胰島素，從而導(dǎo)致胰島素水平升高。

2.5 IR相關(guān)指數(shù)分析

IR相關(guān)指數(shù)結(jié)果如表3。

表3 IR相關(guān)指數(shù)Table 3 Insulin resistance related index

MG-bLG組的HOMA-IR水平為4.86，顯著高于C 組的 3.12（P<0.05），MG-bLG 組的 HOMA-IS指數(shù)為0.21，顯著低于C組的0.28（P<0.05），說明小鼠長時(shí)間攝入MG-bLG會(huì)增加胰島素抗性，降低胰島素敏感性。MG-bLG組的HOMA-β指數(shù)為84.94%，低于C組的107.79%，但無顯著性差異，說明MG-bLG對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞無顯著性影響。通過上述分析可知，MG-bLG可通過促進(jìn)IR，從而增大2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)。

2.6 血清中AGEs水平

MG-bLG對(duì)小鼠血清中AGEs水平的影響如圖3所示。

圖3 MG-bLG對(duì)小鼠血清AGEs水平的影響Fig.3 The effect of MG-bLGon the concen tration of AG Esinmice

由圖3可知，與C組相比，灌胃攝入MG-bLG后，小鼠血清中AGEs水平升高至131.99 pg/mL，是C組AGEs水平（43.88 pg/mL）的 3倍（P<0.05），說明 MG-bLG可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)AGEs的累積，此結(jié)果與現(xiàn)有關(guān)于胰島抵抗和2型糖尿病模型中的研究結(jié)果一致。有研究表明，2型糖尿病患者體內(nèi)AGEs含量高于健康個(gè)體[30]。通過HOMA-IR評(píng)估發(fā)現(xiàn)AGEs的循環(huán)水平與胰島素抵抗相關(guān)，即使在非肥胖的非糖尿病受試者中也是如此[31]。說明MG-bLG的長時(shí)間攝入可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)AGEs水平升高。

3 結(jié)論

MG-bLG攝入導(dǎo)致小鼠體重和攝食量增大，F(xiàn)BG升高，并促進(jìn)胰島素的合成和分泌增到，進(jìn)而導(dǎo)致HOMA-IR增大，HOMA-IS減小。此外小鼠血清內(nèi)AGEs水平升高，LDL-C、TG和T-CHO水平升高，說明長時(shí)間攝入蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs可改變機(jī)體糖脂代謝，促進(jìn)機(jī)體IR，增加機(jī)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)盡量降低飲食中攝入過多的蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)AGEs，以免其誘導(dǎo)機(jī)體IR甚至是糖尿病的發(fā)生。