苯并(a)芘誘導(dǎo)對(duì)雙齒圍沙蠶腺苷酸環(huán)化酶(AC)基因及酶活性表達(dá)的影響

孫嘉，黃藝，韓萍，李婉娟，楊大佐，喬寧，劉珍伶，趙歡

(大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

苯并(a)芘[benzo(a)pyrene， B(a)P]是一類(lèi)廣泛存在于水體中的環(huán)境污染物，來(lái)源于石油海上開(kāi)采和運(yùn)輸過(guò)程中的泄露，以及生活污水和工業(yè)污水的排放等。B(a)P的親脂性使其極易進(jìn)入水生生物體內(nèi)，引起組織損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前，在貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等多種水生生物中已有相關(guān)報(bào)道，如櫛孔扇貝Chlamysfarreri暴露于10 μg/L B(a)P 20 d后，其鰓絲上皮細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞損傷[1]；鯉暴露于含有0.1～1.0 μg/L B(a)P的水體30 d后，其肝、腎組織的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽酶(GSH)活性均降低，并出現(xiàn)組織損傷[2]；極地鱈Boreogadussaida連續(xù)投喂含20.3 μg/g B(a)P的飼料14 d后，其肝臟中檢測(cè)出B(a)P生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵產(chǎn)物[3-hydroxybenzo(a)pyrene，3-OH-BaP]的存在，表明B(a)P誘導(dǎo)極地鱈魚(yú)肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。B(a)P進(jìn)入生物體內(nèi)可通過(guò)芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor， AHR)介導(dǎo)調(diào)控通路對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，近期研究發(fā)現(xiàn),包括B(a)P在內(nèi)的多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)的芳香烴分子結(jié)構(gòu)含有G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)配體，推測(cè)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路也可能參與調(diào)控多環(huán)芳烴對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)[4-8]。

G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路通過(guò)外源及內(nèi)源性刺激信號(hào)與GPCRs的識(shí)別，活化G蛋白，從而影響細(xì)胞內(nèi)包括cAMP(Cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate)信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)調(diào)控通路。cAMP信號(hào)通路也稱(chēng)PKA系統(tǒng)(Protein kinase A system, PKA)，當(dāng)外界信號(hào)刺激或細(xì)胞內(nèi)代謝條件發(fā)生變化，Gɑ亞基的首要效應(yīng)酶——腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)的表達(dá)隨之發(fā)生變化，致使胞內(nèi)內(nèi)環(huán)腺苷3′,5′-單磷酸腺苷(cAMP)水平發(fā)生變化，從而引起細(xì)胞反應(yīng)[9-10]。有報(bào)道表明，水溶性毛喉素類(lèi)似物NKH 477(water-soluble forskolin analogue)(0.1～150 μm)會(huì)刺激蜜蜂ApismelliferaAC2t、AC8基因的熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)性增加，促進(jìn)機(jī)體cAMP的生成[11]。注射嗎啡后，短時(shí)間內(nèi)小鼠AC活性及cAMP水平會(huì)有所降低，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠AC活性和cAMP水平逐漸升高[12]。目前，關(guān)于AC的研究多集中在脊椎動(dòng)物中，而對(duì)其他無(wú)脊椎動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。

多毛類(lèi)動(dòng)物生活在沿海的沉積質(zhì)中，屬于底棲無(wú)脊椎動(dòng)物[13]，是海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)中的重要組成成員。目前，關(guān)于持久性有機(jī)污染物對(duì)多毛類(lèi)的毒性效應(yīng)研究大多集中于解毒代謝及抗氧化相關(guān)調(diào)控因子方面，關(guān)于持久性有機(jī)污染物對(duì)多毛類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得了雙齒圍沙蠶PerinereisaibuhitensisG蛋白α亞基(Gα)和GPCR基因，并發(fā)現(xiàn)雙酚A(bisphenol A，BPA)或 B(a)P可誘導(dǎo)Gα和GPCR基因的表達(dá)，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，推斷G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路可能參與外源物質(zhì)對(duì)沙蠶的毒性效應(yīng)[14-15]。為了進(jìn)一步探討G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)調(diào)控通路在雙齒圍沙蠶對(duì)有機(jī)污染物毒性響應(yīng)中的作用，本研究中以 B(a)P為特征污染物，在獲得AC基因cDNA全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，分析了B(a)P誘導(dǎo)下雙齒圍沙蠶AC基因表達(dá)及AC酶活性變化，旨在為深入研究B(a)P對(duì)多毛類(lèi)動(dòng)物的毒性效應(yīng)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雙齒圍沙蠶購(gòu)自遼寧省大連市黑石礁小夏漁具店，其體質(zhì)量為1.5～2.5 g，挑選有活力的完整個(gè)體于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周，控制水溫為(18±0.5)℃，鹽度為31～32，pH值為8.25±0.10，每24 h換水一次。

試驗(yàn)試劑：RNAisoTMPlus、PrimeScriptTMRT-PCR Kit、Premix Ex TaqTMHot Start Version、SMARTer?RACE(rapid amplification of cDNA ends) 5′/3′Kit、PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa公司；Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞和pEASY-Blunt Cloning Vector購(gòu)自全式金生物技術(shù)(大連)有限公司；TIANGEN?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；腺苷酸環(huán)化酶(AC)酶聯(lián)免疫分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自上?？婆d商貿(mào)有限公司；苯并(a)芘(純度≥96%)購(gòu)自 Sigma 公司；丙酮(純度≥99.5%)購(gòu)自天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 將沙蠶整體用液氮進(jìn)行研磨，稱(chēng)取0.1 g樣品，用RNAisoTMPlus試劑提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙齒圍沙蠶ACcDNA全長(zhǎng)序列的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室雙齒圍沙蠶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中已經(jīng)驗(yàn)證的AC中間片段序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)RACE特異性引物，RACE引物如表1所示。利用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit，以“1.2.1”節(jié)中獲得的RNA為模板，合成3′ RACE 和5′RACE cDNA，以3′RACE cDNA 為模板進(jìn)行AC3′RACE擴(kuò)增，試驗(yàn)采用巢式PCR方法。

表1 試驗(yàn)用引物信息Tab.1 Primers used in the study

Outer PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)體系(共50 μL)包括：PCR-Grade Water 15.5 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，3′RACE cDNA 2.5 μL，10×UPM(Universal Primer A Mix)5.0 μL，AC-F1(10 μmol/L)1.0 μL。

Outer PCR反應(yīng)程序：94 ℃下循環(huán)變性30 s，61.9 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取 5.0 μL Outer PCR 產(chǎn)物加入245 μL TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)，取5.0 μL稀釋后的Outer PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 Inner PCR。

Inner PCR反應(yīng)體系(共50 μL)包括：Outer PCR 反應(yīng)液 5.0 μL，PCR-Grade Water 17.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，Universal Primer Short (10 μmol/L)1.0 μL，AC-F2(10 μmol/L)1.0 μL。

Inner PCR反應(yīng)條件：94 ℃下循環(huán)變性30 s，68 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。采用普通PCR方法進(jìn)行AC5′RACE擴(kuò)增，反應(yīng)體系同Quter PCR。

5′RACE反應(yīng)程序同Outer PCR(退火溫度為68 ℃)。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的條帶切膠回收、轉(zhuǎn)化鏈接，選取陽(yáng)性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。將3′和5′RACE擴(kuò)增序列進(jìn)行拼接獲得AC全長(zhǎng)序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3AC序列分析 利用BioEdit軟件進(jìn)行拼接分析，得到ACcDNA全長(zhǎng)序列。利用NCBI ORF Finder程序?qū)ふ译p齒圍沙蠶AC基因的開(kāi)放閱讀框，并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，利用ProtParam 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，利用PSORTⅡ軟件預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置，利用ScanProsite 軟件對(duì)氨基酸序列修飾位點(diǎn)進(jìn)行分析，利用TMHMM 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的分析，利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Clustal軟件對(duì)雙齒圍沙蠶多重序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件采用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自檢重復(fù)為 1000 次。

1.2.4 B(a)P誘導(dǎo)試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)B(a)P濃度，分別為0.5、5.0、10.0、50.0 μg/L，另設(shè)置丙酮溶劑對(duì)照組(100 μL/L)和海水空白對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)平行。將0.05 g B(a)P粉末定容于100 mL丙酮中，配制成0.5 g/L的母液備用。誘導(dǎo)試驗(yàn)在玻璃燒杯(2 L)中進(jìn)行，在各濃度組燒杯中注入1 L海水后，分別加入1、10、20、100 μL B(a)P母液混勻，配制試驗(yàn)溶液。每個(gè)平行隨機(jī)挑選10條沙蠶進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期間不投餌，每24 h更換一次海水。于試驗(yàn)第4、7、14天時(shí)取樣，每次從每個(gè)燒杯中隨機(jī)取3條沙蠶，剪取體壁保存用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 總RNA的提取方法同“1.2.1”節(jié)。利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser進(jìn)行樣品反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[13]，選取β-actin作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。使用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系(共20 μL)包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性 30 s；95 ℃下變性 5 s，60 ℃下退火34 s，共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析以確保特異性擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用ABI 7500 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 AC酶活性測(cè)定 將沙蠶整體用液氮進(jìn)行研磨，稱(chēng)取0.1 g樣品，加入0.9 mL PBS(phosphate buffer saline)(pH 7.4)緩沖液，用勻漿器將樣品充分混勻，于4 ℃下離心20 min(2500 r/min)，吸取上清液，制成10%組織勻漿，冷凍備用。采用ELISA試劑盒測(cè)定AC酶活性，計(jì)算方法和原理均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC基因cDNA序列特征分析

經(jīng)克隆獲得雙齒圍沙蠶AC序列全長(zhǎng)為4900 bp，其中，5′端非編碼區(qū)為127 bp，3′端非編碼區(qū)為1536 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?237 bp，編碼1078個(gè)氨酸(GenBank登錄號(hào)：KX792262.1)。該氨基酸序列具有兩個(gè)保守的環(huán)化酶同源結(jié)構(gòu)域(Cyclase homology domains，CHDs)，分別位于274～458 aa和843～1040 aa(圖1)，在兩個(gè)環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域(Cyclase catalytic domain，CYCc)中分別具有保守的核酸結(jié)合位點(diǎn)——金屬結(jié)合位點(diǎn)和多肽結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測(cè)該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為122 595.92，理論等電點(diǎn)(pI)為8.70。使用 PSORTⅡ軟件對(duì)AC進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜上的概率最高為69.6%，推測(cè)該蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)膜上。對(duì)AC蛋白序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白具有2個(gè)明顯的跨膜區(qū)域，每個(gè)跨膜區(qū)域包括6個(gè)跨膜區(qū)(Transmembrane helixs，TM)，分別位于49～71、81～98、105～127、137～156、161～183、189～211、586～608、613～635、648～670、709～729、731～753、763～785 aa，這與細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致，表明該蛋白屬于膜蛋白。使用SOPMA軟件對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白由47.03% α-螺旋、9.83% β-轉(zhuǎn)角、22.63%無(wú)規(guī)則卷曲和20.50%延伸鏈組成。使用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，該蛋白包含由兩個(gè)βαββαβ二級(jí)結(jié)構(gòu)基序組成的掌狀結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)電子版附圖1)。

2.2 AC氨基酸多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將雙齒圍沙蠶與其他物種AC氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示，雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列在保守的環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域部分與其他物種同源性較高，在其他區(qū)域同源性較低(見(jiàn)電子版附圖2)。雙齒圍沙蠶AC序列與軟體動(dòng)物門(mén)的福壽螺Pomaceacanaliculata、長(zhǎng)牡蠣CrassostreagigasAC1的一致性最高，為47%，與蝦夷扇貝MizuhopectenyessoensisAC的一致性為46%，與節(jié)肢動(dòng)物門(mén)的天牛Anoplophoraglabripennis、溫帶臭蟲(chóng)Cimexlectularius、鱟Limuluspolyphemus、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、溫室擬肥腹蛛Parasteatodatepidariorum、果蠅Drosophilaficusphila、家蠶Bombyxmori和南美白對(duì)蝦PenaeusvannameiAC序列的一致性為41%～45%，與高等脊椎動(dòng)物大刺鰍Mastacembelusarmatus、大西洋鯡Clupeaharengus、青鳉Oryziaslatipes、白喉帶鹀Zonotrichiaalbicollis、大山雀Parusmajor和鼴鼠FukomysdamarensisAC序列的一致性為34%～37%，稍低于無(wú)脊椎動(dòng)物。

對(duì)雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2)，其中，無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物分為兩大支，雙齒圍沙蠶AC在無(wú)脊椎動(dòng)物分支中首先與軟體動(dòng)物聚為一支，后與節(jié)肢動(dòng)物聚為一大支。

2.3 B(a)P誘導(dǎo)下AC基因的表達(dá)

從圖3可知：試驗(yàn)過(guò)程中，丙酮溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明丙酮作為溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，各B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因相對(duì)表達(dá)量呈不同的變化趨勢(shì)，0.5、10 μg/L濃度組呈先升高后下降，而5、50 μg/L濃度組則持續(xù)升高；暴露第4天時(shí)，0.5、5、10、50 μg/L濃度組雙齒圍沙蠶AC表達(dá)量較對(duì)照組升高，分別為空白對(duì)照組的1.46、3.01、3.17和1.36倍，且與空白對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；暴露第7天時(shí)，各B(a)P濃度組AC表達(dá)量較第4天時(shí)均有升高，分別為空白對(duì)照組的5.30、5.03、3.65和2.23倍，0.5、10 μg/L濃度組AC表達(dá)量達(dá)到最大值，其中，僅0.5 μg/L濃度組與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；暴露第14天時(shí)，5、50 μg/L濃度組AC表達(dá)量較第7天時(shí)有所升高并達(dá)到最大值，分別為空白對(duì)照組的5.45和2.89倍，僅5 μg/L濃度組與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，而0.5、10 μg/L濃度組AC表達(dá)量與第7天時(shí)相比略有下降。

2.4 B(a)P誘導(dǎo)下AC酶活性的變化

從圖4可見(jiàn)：各B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC酶活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)呈波動(dòng)變化趨勢(shì)；暴露第4天時(shí)，0.5、5、50 μg/L濃度組AC酶活性與空白對(duì)照組相比升高，并達(dá)到最大值，各濃度組分別為36.18、35.22、30.16 U/L，其中，0.5 μg/L濃度組與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，為空白對(duì)照組的1.28倍，而10 μg/L濃度組較空白對(duì)照組有所抑制，酶活性為25.40 U/L；暴露第7天時(shí)，各濃度組AC酶活性均高于空白對(duì)照組(P>0.05)，而10 μg/L濃度組AC酶活性較第4天時(shí)有所升高并達(dá)到最大值，為29.38 U/L；暴露第14天時(shí)，0.5、5 μg/L濃度組AC酶活性較第7天時(shí)有所升高，10、50 μg/L濃度組AC酶活性與第7天相比呈下降趨勢(shì)，但各濃度組AC酶活性與空白對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 AC基因的序列分析

腺苷酸環(huán)化酶(AC)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的重要信號(hào)分子，在外界信號(hào)刺激和細(xì)胞內(nèi)代謝變化的情況下，AC催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)分解生成第二信使cAMP。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度≤10-6mol/L，當(dāng)AC被激活后，cAMP水平急劇增加，將信號(hào)傳導(dǎo)至下游調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程，使靶細(xì)胞產(chǎn)生快速應(yīng)答機(jī)制[16]。目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了10種AC異構(gòu)體(isoforms)，其中，AC1～AC9是跨膜AC(transmembrane ACs,tmACs)亞家族，其活性主要通過(guò)細(xì)胞外激素和神經(jīng)遞質(zhì)激活G蛋白耦連受體后，由異體G蛋白調(diào)節(jié)[17]；AC10屬于可溶性AC(soluble,sAC)，由AC10基因編碼[18]，其游離于細(xì)胞質(zhì)及其包含的亞細(xì)胞器中[19-20]。在蛋白結(jié)構(gòu)特征中所有AC均含有2個(gè)高度同源的環(huán)化酶同源結(jié)構(gòu)域CHDs和2個(gè)由跨膜α-螺旋組成的整合結(jié)構(gòu)域(TM1-TM6和TM7-TM12)，這些結(jié)構(gòu)交錯(cuò)排列形成CHD-TM結(jié)構(gòu)單元。AC的催化結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)區(qū)，有高度相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成一個(gè)對(duì)稱(chēng)的界面(pseudosymmerical interface)，并在界面上由兩者的互補(bǔ)殘基共同參與構(gòu)成了AC催化活性位點(diǎn)。對(duì)本研究中克隆得到的雙齒圍沙蠶AC進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列同樣含有兩個(gè)保守的CHDs，分別位于274～458 aa和843～1040 aa，證實(shí)獲得的氨基酸序列屬于AC。在該蛋白序列的保守CHD1中還發(fā)現(xiàn)，存在于其他物種氨基酸序列的兩個(gè)保守金屬離子結(jié)合位點(diǎn)Asp288和Asp332，該位點(diǎn)在催化過(guò)程中通過(guò)結(jié)合作為輔助因子的Mg2+或Mn2+啟動(dòng)催化反應(yīng)。

同源序列比對(duì)顯示，雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列與其他物種的一致性為34%～47%，其中，在環(huán)化酶同源區(qū)域同源性較高，而在其他區(qū)域同源性較低。環(huán)化酶同源區(qū)域的高同源性表明，AC氨基酸主要功能區(qū)域在不同物種中相對(duì)比較保守，而在其他區(qū)域的低同源性可能與不同物種AC功能的差異存在一定的相關(guān)性。研究表明，不同亞型跨膜ACs保留在細(xì)胞質(zhì)中的肽鏈N-端和C-端的序列和長(zhǎng)度差別比較明顯，這些區(qū)域的差別可能與不同亞型跨膜AC的靶向定位及寡聚化的差別有關(guān)[21]。本研究中得到的雙齒圍沙蠶AC氨基酸與其他物種AC氨基酸序列在其他區(qū)域的差別表明，其在雙齒圍沙蠶中的功能可能與其他物種存在一定差異。多重序列比對(duì)顯示，該蛋白序列與軟體動(dòng)物門(mén)AC序列的同源性較高，基因結(jié)構(gòu)分析亦顯示，蛋白序列中具有多個(gè)鈣調(diào)蛋白(CaM)共識(shí)位點(diǎn)。哺乳動(dòng)物中已鑒定的9種AC亞型，根據(jù)AC各個(gè)膜型的調(diào)節(jié)特點(diǎn)可分為4組，其中，AC1、AC3和AC8屬于第1組，它們可以由鈣活化的CaM誘導(dǎo)激活[22]。由此推測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)的雙齒圍沙蠶AC蛋白可能亦屬于第1組AC。而不同物種AC1到AC8在結(jié)構(gòu)上具有較高相似性，肽鏈N-端和C-端序列及長(zhǎng)度的差別會(huì)造成其功能的差異性，故需通過(guò)進(jìn)一步相關(guān)AC功能驗(yàn)證分析來(lái)最終確定AC蛋白的類(lèi)別。

3.2 污染物脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶AC基因及AC酶活性表達(dá)的影響

AC是cAMP信號(hào)通路的主要調(diào)控因子，AC活性的改變會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，從而調(diào)節(jié)機(jī)體生理過(guò)程。有研究表明,在貝類(lèi)應(yīng)對(duì)污染物及環(huán)境因子等脅迫時(shí)AC/cAMP調(diào)控通路能夠發(fā)揮重要作用[23]。如Li等[24]發(fā)現(xiàn),酸化會(huì)激活牡蠣Pinctadafucata體內(nèi)cAMP信號(hào)通路中AC、cAMP和PKA等的表達(dá)，以此應(yīng)對(duì)機(jī)體化學(xué)平衡的變化。Fabbri等[25]發(fā)現(xiàn),紫貽貝Mytilusgalloprovincialis暴露于10 ng/L Cr6+和5 μg/L Cu2+7 d后，其鰓組織中AC酶活性及cAMP含量升高。同貝類(lèi)一樣，本研究中，B(a)P脅迫下的雙齒圍沙蠶AC基因表達(dá)及酶活性均出現(xiàn)不同程度的升高，在一定程度上可以說(shuō)明有機(jī)污染物會(huì)引起多毛類(lèi)體內(nèi)AC/cAMP調(diào)控通路發(fā)生改變。但本研究中B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因及酶活性變化與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，分析引起這一現(xiàn)象的原因可能與試驗(yàn)個(gè)體對(duì)持久性有機(jī)污染物耐受性差異有關(guān)。有學(xué)者研究表明，重金屬污染嚴(yán)重地區(qū)的沙蠶種群對(duì)污染物具有異常的適應(yīng)性和高度耐性[26]，故作者認(rèn)為多毛類(lèi)能夠?qū)C的變化表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐性。

此外，本研究結(jié)果顯示，50 μg/L B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因表達(dá)在誘導(dǎo)前7 d低于其他3個(gè)濃度組，AC酶活性在誘導(dǎo)第4天和第14天時(shí)低于0.5、5 μg/L B(a)P濃度組。這與很多關(guān)于重度逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶和解毒代謝酶基因表達(dá)、酶活性均降低的研究結(jié)果相似，如多齒圍沙蠶在B(a)P誘導(dǎo)下CYP3A基因在 50 μg/L B(a)P濃度組的表達(dá)量顯著低于2.5 μg/L B(a)P濃度組[27]；菲和芘單一污染會(huì)脅迫蚯蚓EiseniafoetidaSOD活性表現(xiàn)為低劑量激活、高劑量抑制[28]。由此推測(cè)，雙齒圍沙蠶在高濃度B(a)P誘導(dǎo)下會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，致使AC基因表達(dá)和AC酶活性變化相較于低濃度B(a)P誘導(dǎo)呈抑制現(xiàn)象。

對(duì)比本研究中AC基因表達(dá)和AC酶活性變化的結(jié)果可以看出，10 μg/L濃度組雙齒圍沙蠶AC酶活性的變化規(guī)律與AC基因表達(dá)變化趨勢(shì)相同，而0.5、5、50 μg/L濃度組AC酶活性與AC基因表達(dá)呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。B(a)P誘導(dǎo)下雙齒圍沙蠶ACmRNA表達(dá)量變化與酶活性變化呈現(xiàn)出不一致性，推測(cè)可能是因?yàn)榘╩RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后修飾等因素都會(huì)影響蛋白表達(dá)，這可能造成酶活性變化與mRNA表達(dá)水平的不一致[29]；亦或者是因?yàn)槭艿轿廴竞驛C活性最先被誘導(dǎo)，隨后基因被誘導(dǎo)表達(dá)，呈現(xiàn)出時(shí)間上的差異。關(guān)于雙齒圍沙蠶AC酶活性與基因編碼調(diào)控間的相互作用機(jī)制，今后將進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié)論

(1)本研究中首次克隆獲得了雙齒圍沙蠶AC基因全長(zhǎng)序列，該基因全長(zhǎng)4900 bp，編碼1078個(gè)氨基酸，該序列屬于第1組AC。

(2)B(a)P誘導(dǎo)可以上調(diào)雙齒圍沙蠶AC基因表達(dá)并激活A(yù)C酶活性，而高濃度B(a)P會(huì)對(duì)雙齒圍沙蠶產(chǎn)生重度脅迫。本研究表明，持久性有機(jī)污染物B(a)P會(huì)引起多毛類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)AC/cAMP調(diào)控通路發(fā)生改變，從而促進(jìn)多毛類(lèi)動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)。