湖州地區(qū)漁用飼料中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留分析

徐磊　盛鵬程　屠仁千　孫博懌

摘要? ? 為了解湖州地區(qū)漁用飼料中抗生素的污染水平，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，對(duì)湖州地區(qū)漁用飼料中的土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素開(kāi)展了檢測(cè)分析。結(jié)果表明，飼料中四環(huán)素類(lèi)抗生素的加標(biāo)回收率很低，需要用基質(zhì)加標(biāo)的方法去定量才能保證回收率以滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。在18份飼料樣品中，共有8份飼料樣品中測(cè)出1～3種四環(huán)素類(lèi)抗生素，檢出率為44.4%;其中金霉素的檢測(cè)率最高，為33.3%。不同養(yǎng)殖品種所用的飼料中四環(huán)素類(lèi)抗生素含量存在差異，這一方面與養(yǎng)殖模式有關(guān)，另一方面也與養(yǎng)殖場(chǎng)的管理混亂有關(guān)。

關(guān)鍵詞? ? 漁用飼料;四環(huán)素類(lèi)抗生素;回收率;污染水平;浙江湖州

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S816.7? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）09-0217-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? In order to understand the pollution level of antibiotics in fishery feed in Huzhou area，the detection and analysis of oxytetracycline，chlortetracycline，tetracycline and doxycycline in fishery feed in Huzhou area were carried out by using ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry.The results showed that the recovery rate of tetracycline antibiotics was very low，and it needs to be quantified by matrix addition to ensure that the recovery rate can meet the experimental requirements.Among the 18 feed samples，1-3 kinds of tetracycline antibiotics were detected in 8 feed samples，the detection rate was 44.4%，among which the detection rate of chlortetracycline was the highest（33.3%）.The content of tetracycline antibiotics in the feed of different breed was different.On the one hand，it was related to the breeding mode;on the other hand，it was also related to the management confusion of the farm.

Key words? ? fishery feed;tetracycline antibiotic;recovery rate;pollution level;Huzhou Zhejiang

抗生素是生物（包括微生物、植物和動(dòng)物）在其生命活動(dòng)過(guò)程中所產(chǎn)生的（或由其他方法獲得的）有機(jī)代謝產(chǎn)物，能在低微濃度下選擇性地抑制或影響其他生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其衍生物[1]。其中，四環(huán)素類(lèi)抗生素（tetracyclines，TCs）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)廣譜抗生素[2]，包括金霉素（chlortet-racycline）、土霉素（oxytetracycline）、四環(huán)素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等。作為目前我國(guó)生產(chǎn)和使用最廣泛的抗生素之一，四環(huán)素類(lèi)抗生素被廣泛地運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，其中一種方法便是將抗生素添加到飼料中。

飼料中大量添加四環(huán)素類(lèi)抗生素會(huì)導(dǎo)致藥物在生物體內(nèi)的殘留以及抗藥菌株的產(chǎn)生[3-5]，目前許多國(guó)家對(duì)飼料中添加四環(huán)素類(lèi)進(jìn)行了嚴(yán)格的監(jiān)控[6-7]。我國(guó)在2018年4月，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案（2018—2021年）》，力爭(zhēng)通過(guò)3年時(shí)間，實(shí)施養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作，而藥物飼料添加劑計(jì)劃將于2020年全部退出。

浙江湖州自古被譽(yù)為絲綢之府、魚(yú)米之鄉(xiāng)，是我國(guó)著名的十大淡水魚(yú)養(yǎng)殖基地。漁業(yè)作為湖州農(nóng)業(yè)的首位產(chǎn)業(yè)，2018年漁業(yè)總產(chǎn)值已突破100億元，然而湖州地區(qū)漁用飼料中抗生素的殘留情況研究目前仍是空白。本研究以湖州水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要使用飼料為研究對(duì)象，建立一套方便快捷的四環(huán)素類(lèi)檢測(cè)方法，并對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的污染水平進(jìn)行初步分析，以了解飼料中四環(huán)素類(lèi)抗生素的殘留狀況。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 樣品采集

采集時(shí)間為2017年4月，飼料來(lái)自于湖州地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，采集點(diǎn)分布情況見(jiàn)表1，養(yǎng)殖品種主要選擇的是湖州地區(qū)最主要的養(yǎng)殖品種，采樣點(diǎn)主要分布于東、西苕溪周邊以及南太湖沿岸（圖1）。

1.2? ? 儀器和材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQ MS/I-CLASS系列，美國(guó)Waters公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）;氮吹儀（美國(guó)Orgnomation公司）;冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）;固相萃取裝置（美國(guó)SUPELCO公司）。

鹽酸土霉素（OTC）、鹽酸金霉素（CTC）、鹽酸四環(huán)素（TC）、鹽酸強(qiáng)力霉素（DOX）均來(lái)自德國(guó)Dr. Ehrensorfer公司。

Oasis HLB 固相萃取小柱（225 mg/Oasis HLB Plus Short cartridges，美國(guó)Waters公司）。

SAX陰離子交換小柱（360 mg/Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Short Cartridge，美國(guó)Waters公司）。

1.3? ? 樣品處理

顆粒狀的飼料研磨后過(guò)20目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g置于50 mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖溶液20 mL（每1 000 mL緩沖溶液中含檸檬酸水合物12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g、Na2EDTA 37.2 g）。渦旋混勻1 min，搖床振蕩20 min，超聲波提取10 min，離心后收集上清液，殘留物重復(fù)提取1次后，合并2次上清液，混勻后取20 mL過(guò)SAX-HLB串聯(lián)小柱。上樣前，SAX-HLB串聯(lián)柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水和5 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液活化平衡;上樣時(shí)，將稀釋水樣流速控制在5～8 mL/min;上樣后，將上層SAX柱取下后用10 mL超純水淋洗 HLB 柱，負(fù)壓抽干后置于冷凍干燥機(jī)中干燥10 min;最后用6 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容至1.0 mL。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 質(zhì)量控制

四環(huán)素類(lèi)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。以空白飼料為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，2.00 g飼料中分別加入10 ng和50 ng混合標(biāo)準(zhǔn)品，飼料中四環(huán)素類(lèi)抗生素的回收率為23.5%～45.9%，其中土霉素的回收率最低、四環(huán)素回收率最高?；厥章蔬^(guò)低，無(wú)法滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。因此，本試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白飼料樣品加標(biāo)的方法制備，在2.00 g空白飼料中分別加入2、4、10、25、50、100 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/L），與樣品同步處理。4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.927 633～0.965 244之間，回收率為71.5%～129.4%（表2），滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。以S/N

≥3作為方法的最低檢出限，飼料中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢出限為0.50～2.00 ng/g（圖2）。

2.2? ? 飼料樣品中抗生素殘留狀況

在采集的18個(gè)飼料中，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，共有8個(gè)飼料樣品檢測(cè)出1～3種四環(huán)素類(lèi)抗生素，檢出率為44.4%。4種抗生素中CTC的檢測(cè)率最高，為33.3%。其中，S5處青蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的飼料中檢測(cè)出最高濃度，分別為CTC 2 580.00 ng/g、TC 546.00 ng/g、DOX 425.00 ng/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他7個(gè)飼料樣品中測(cè)出的濃度。由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中四環(huán)素類(lèi)抗生素主要用于防治魚(yú)類(lèi)的腸炎病、赤皮病等病害，如果人為在飼料中添加，一般添加量在10～100 mg/kg之間才會(huì)有治療效果[8]。本研究中S5處飼料測(cè)得的四環(huán)素類(lèi)濃度為0.425～2.580 mg/kg，遠(yuǎn)低于一般的添加量，因而可以認(rèn)為飼料中的抗生素并非是養(yǎng)殖戶(hù)人為添加的。如果飼料中的抗生素并非是養(yǎng)殖戶(hù)人為添加，那么漁用飼料中的抗生素來(lái)源一般有2種，一是飼料加工廠的人為添加，二是養(yǎng)殖戶(hù)在養(yǎng)殖過(guò)程中因管理混亂所導(dǎo)致的污染。S5處飼料應(yīng)該是屬于第2種情況。雖然理論上要求在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中飼料與魚(yú)藥要分開(kāi)存放，但在實(shí)際的操作過(guò)程中，這一點(diǎn)很容易被養(yǎng)殖戶(hù)忽略，當(dāng)飼料與魚(yú)藥同時(shí)存放在同一個(gè)儲(chǔ)藏間內(nèi)，難免會(huì)發(fā)生一些交叉污染，從而在飼料中檢測(cè)出高濃度的抗生素殘留。

2.3? ? 不同水產(chǎn)養(yǎng)殖品種飼料中的抗生素殘留分析

在9個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中，有6個(gè)品種的飼料檢測(cè)出含有四環(huán)素類(lèi)抗生素，其中泥鰍、青蝦的4個(gè)飼料中抗生素檢出率為100%。泥鰍作為一種高密度的養(yǎng)殖品種，屬于無(wú)鱗魚(yú)類(lèi)，容易發(fā)生腐皮類(lèi)的病害，四環(huán)素類(lèi)抗生素在這方面有不錯(cuò)的效果。青蝦作為湖州地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)，2018年的總產(chǎn)量占浙江省總產(chǎn)量的68%。由于青蝦的養(yǎng)殖密度低，養(yǎng)殖模式也比較簡(jiǎn)單，很少發(fā)生病害，在養(yǎng)殖過(guò)程中一般不需要投放藥物。S5和S6這2份飼料中檢測(cè)出四環(huán)素類(lèi)抗生素，S5是由于飼料被污染導(dǎo)致的，S6應(yīng)該是在飼料的生產(chǎn)過(guò)程中加入的，至于原因，仍需要進(jìn)一步調(diào)查。

從表4可以看出，外塘甲魚(yú)飼料中含有的四環(huán)素類(lèi)抗生素最多，另外有3個(gè)品種中未測(cè)出抗生素，分別是溫室甲魚(yú)、青魚(yú)和烏鱧。有研究表明，在溫室甲魚(yú)的池塘水中可以檢測(cè)出多組分、高濃度的抗生素，其中就包含有四環(huán)素類(lèi)抗生素[8]。本研究中的2個(gè)溫室甲魚(yú)飼料樣品中均未檢測(cè)出四環(huán)素類(lèi)抗生素，一方面是因?yàn)闄z測(cè)的飼料樣品批次過(guò)少;另一方面可能是因?yàn)樵跍厥壹佐~(yú)的養(yǎng)殖過(guò)程中，主要預(yù)防肺炎和出血病，一般用的比較多的藥物是頭孢類(lèi)和氧氟沙星，四環(huán)素類(lèi)抗生素并非是主要用藥。青魚(yú)的養(yǎng)殖周期比較長(zhǎng)，一般養(yǎng)殖密度也不會(huì)很大，所以養(yǎng)殖過(guò)程中病害相對(duì)較少，對(duì)于藥物的依賴(lài)性比較低。烏鱧是一個(gè)高密度的養(yǎng)殖品種，近些年以來(lái)，隨著對(duì)漁業(yè)環(huán)境的越發(fā)重視，導(dǎo)致地方一直在推廣投喂飼料的養(yǎng)殖模式，但這種模式卻始終有弊端，在養(yǎng)殖后期烏鱧的畸形率明顯高于投喂冰鮮的養(yǎng)殖模式。因此，有不少養(yǎng)殖戶(hù)仍然在延用以前投喂冰鮮的養(yǎng)殖模式或者是混合投喂的養(yǎng)殖模式（前期投喂飼料，后期投喂雞肝、鴨肝等冰鮮），所以烏鱧在養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)飼料的依賴(lài)性比較低，這可能是烏鱧飼料中抗生素濃度低的一個(gè)原因。

由此可見(jiàn)，飼料中的抗生素含量與水產(chǎn)品的養(yǎng)殖模式密切相關(guān)，包括投喂方式、病害情況、用藥習(xí)慣等。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的四環(huán)素類(lèi)抗生素，當(dāng)以空白飼料為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)時(shí)，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的回收率均很低，無(wú)法滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。本研究最終采用在空白飼料樣品中加標(biāo)的方法制備抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的回收率可以達(dá)到71.5%～124.9%。

在采集的18個(gè)飼料中，共有8種飼料樣品中測(cè)出1～3 種四環(huán)素類(lèi)抗生素，檢出率為44.4%。檢測(cè)出最高濃度分別為CTC（2 580 ng/g）、TC（546 ng/g）、DOX（425 ng/g）。這應(yīng)該是養(yǎng)殖過(guò)程中管理混亂所導(dǎo)致的交叉污染現(xiàn)象。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)管理，嚴(yán)禁將飼料與魚(yú)藥放在同一個(gè)儲(chǔ)藏間內(nèi)。

不同飼料中的抗生素殘留差距較為明顯，飼料中的抗生素含量與水產(chǎn)品的養(yǎng)殖模式密切相關(guān)，包括投喂方式、病害情況、用藥習(xí)慣等。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] 梁惜梅，施震，黃小平.珠江口典型水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)抗生素的污染特征[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2013（2）：126-132.

[2] 李俊鎖，邱月明，王超，等.獸藥殘留分析[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.

[3] 周啟星，羅義，王美娥.抗生素的環(huán)境殘留、生態(tài)毒性及抗性基因污染[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2007，2（3）：243-251.

[4] ZOU S，XU W，ZHANG R，et al.Occurrence and distribution of antibiot-ics in coastal water of the Bohai Bay，China：impacts of river discharge and aquaculture activities[J].Environmental Pollution，2011，159（10）：2913-2920.

[5] 劉葉新，周志洪，區(qū)暉，等.珠江廣州河段沉積物中典型抗生素的污染特征[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，50（4）：52-58.

[6] 張美金，林峰，林海丹，等.飼料中四環(huán)素類(lèi)藥物含量的高效液相色譜測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2007（6）：918-920.

[7] 鄭衛(wèi)東，胡丹，鄭海峰.數(shù)理統(tǒng)計(jì)技術(shù)在化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制中的運(yùn)用[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013（3）：950-953.

[8] 徐磊，孫博懌，盛鵬程，等.湖州地區(qū)典型水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中抗菌藥物的污染特征[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：210-214.