HPLC同時(shí)測(cè)定雙烏止痛酊中3種單酯型生物堿的含量

李金慈，陳 琛，王 爭(zhēng)，陳 星，閆 冰，蘇 華

（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002 ）

雙烏止痛酊為東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院院內(nèi)制劑，由制川烏、制草烏、制天南星、丁香、細(xì)辛等十余味中藥組成，具有祛風(fēng)止痛、舒經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床主要用于治療關(guān)節(jié)腫痛、肩周炎、急性扭傷和挫傷等，療效顯著。方中制川烏、制草烏為君藥，其主要活性成分為雙酯型烏頭堿經(jīng)炮制水解后生成的單酯型生物堿，既為功效成分，同時(shí)也是毒性成分。雙酯型二帖生物堿毒性最強(qiáng)但性質(zhì)不穩(wěn)定，易被水解，其C8位上的乙酰基水解時(shí)失去一分子醋酸，得到相應(yīng)的苯甲酰單酯型烏頭原堿類，毒性為烏頭堿的1/50～1/500，若繼續(xù)水解，其C14位上苯甲酰基失去一分子苯甲酸生成醇胺型生物堿，毒性僅為烏頭堿的1/2000～1/4000[1]。

目前，關(guān)于含制烏頭類毒/效成分的成方制劑的質(zhì)控研究較少。2015年版中國(guó)藥典共收載了62個(gè)含有川烏、草烏或附子的成方制劑，其中僅附桂骨痛片/膠囊/顆粒以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的總量[2]。在本院雙烏止痛酊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅規(guī)定了苯甲酰新烏頭原堿的含量標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而，由于烏頭產(chǎn)地、批次、炮制工藝等的不同，導(dǎo)致生物堿含量有差異。出于對(duì)用藥安全的考慮，重新評(píng)價(jià)該制劑，優(yōu)化雙烏止痛酊的質(zhì)量控制方法十分必要。因此，本研究擬建立HPLC同時(shí)測(cè)定雙烏止痛酊中3種單酯型生物堿的含量，以期更加全面的控制該制劑的安全性和有效性，并為臨床安全使用含烏頭類制劑提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司，包括G1311B四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1330B恒溫箱、G4212B DAD檢測(cè)器、OpenLAB CDS ChemStation工作站）；HH6型電熱恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）； FA1604S型電子天平（上海天平儀器廠）；AE240型電子分析天平（0.01 mg，梅特勒—托利多儀器有限公司）。以上儀器均檢定合格，實(shí)驗(yàn)所用玻璃量具均經(jīng)過校驗(yàn)合格。

1.2 試藥

苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)111795-201604，純度94.0 %），苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)111794-201705，純度99.1 %），苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)111796-201705，純度98.6 %）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（美國(guó)TEDIA公司）、磷酸（美國(guó)Aladdin公司）為色譜純，鹽酸（上海九億化學(xué)試劑有限公司）、氨水（南京化學(xué)試劑有限公司）、三乙胺（國(guó)藥集團(tuán)）、三氯甲烷（上海試四赫化工有限公司）均為分析純，水為超純水。雙烏止痛酊樣品（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05 %磷酸水溶液（三乙胺調(diào)pH至6.5），梯度洗脫：0～20 min，15 %～21 % A，20～60 min，21 %～24 % A；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μl。理論塔板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿計(jì)算不低于3000。苯甲酰新烏頭原堿的保留時(shí)間約為31 min，苯甲酰烏頭原堿的保留時(shí)間約為37 min，苯甲酰次烏頭原堿的保留時(shí)間約為41 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷（1：1）溶液分別制成每1 ml含0.5593 mg苯甲酰新烏頭原堿、0.1998 mg苯甲酰烏頭原堿、0.1980 mg苯甲酰次烏頭原堿的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密吸取上述3個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，混合，加異丙醇-三氯甲烷（1：1）溶液制成每1 ml含44.744 μg苯甲酰新烏頭原堿、15.984 μg苯甲酰烏頭原堿、15.840 μg苯甲酰次烏頭原堿的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取雙烏止痛酊10 ml至分液漏斗中，加2 %（v/v）鹽酸30 ml，充分搖勻，用氨水調(diào)pH至10，分別用30，30，20 ml三氯甲烷振搖提取，合并三氯甲烷液，低溫（＜40 ℃）蒸干，殘?jiān)赢惐?三氯甲烷（1：1）溶解并定容至5 ml量瓶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 稱取處方量除制川烏、制草烏外的其他藥材，按雙烏止痛酊的制備工藝制成陰性對(duì)照樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各20 μl，按2.1項(xiàng)色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明在苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的保留時(shí)間處無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 雙烏止痛酊HPLC色譜圖

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 ml 至50 ml量瓶，用異丙醇-三氯甲烷（1：1）稀釋至刻度，得系列混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，分別以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品濃度μg/ml為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表1。結(jié)果表明，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的濃度分別在5.593～178.976，1.998～63.936，1.980～63.360 μg/ml之間，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 雙烏止痛酊中3種單酯型生物堿線性回歸方程

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積RSD分別為0.07 %，0.11 %，1.37 %，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（181114）樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，在常溫下分別于0，1，2，4，8 h進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為1.33 %，1.80 %，3.41 %，結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（181114）樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的平均含量分別為25.228，4.273，5.280 μg/ml，RSD分別為2.87 %，2.95 %，2.64 %，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取9份已知含量的雙烏止痛酊樣品（批號(hào)：181114）5 ml，按低、中、高3個(gè)濃度分別精密加入2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.5，2.5，3.5 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，表明該法準(zhǔn)確度良好。

表2 雙烏止痛酊中3種單酯型生物堿加樣回收率試驗(yàn)

2.4 樣品的含量測(cè)定

取10批不同時(shí)間生產(chǎn)的雙烏止痛酊，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 不同批號(hào)雙烏止痛酊中3種單酯型生物堿含量

3 討論

烏頭類中藥在中醫(yī)臨床具有悠久的歷史和顯著的療效，主要包括附子、川烏、草烏3種，其中附子有回陽(yáng)救逆之功，川烏、草烏則長(zhǎng)于祛風(fēng)勝濕止痛。然而此類中藥毒性極強(qiáng)，其中烏頭堿型生物堿是兼具藥理活性和毒性的主要成分。因此，烏頭類中藥制劑需應(yīng)用準(zhǔn)確可靠的方法進(jìn)行科學(xué)合理的含量測(cè)定，使其更加安全合理地用于臨床。

3.1 指標(biāo)成分的選擇

目前文獻(xiàn)報(bào)道的烏頭堿型生物堿的含量測(cè)定多集中于單一的制川烏、制草烏、附子的藥材及炮制品，對(duì)于含烏頭類中藥成方制劑的生物堿含量測(cè)定報(bào)道相對(duì)較少。單酯型烏頭原堿類成分是雙酯型烏頭堿水解后的產(chǎn)物，其毒性大大降低，但仍保留了抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛等藥理活性[4]。2015年版藥典中也以3種單酯型烏頭原堿的總量作為制川烏、制草烏及附子的質(zhì)控指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)選取了3種單酯型生物堿作為雙烏止痛酊的含量測(cè)定指標(biāo)，以期建立多成分測(cè)定的質(zhì)控體系，進(jìn)一步提高其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，保障臨床用藥的安全有效。

3.2 流動(dòng)相體系選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的單酯型生物堿的分析方法多為乙腈-四氫呋喃-0.1 mol/L 醋酸銨體系[5-7]及乙腈-40 mmol/L醋酸銨（氨水調(diào)pH至10）體系[8-9]。鑒于pH為10的流動(dòng)相體系堿性較強(qiáng)，對(duì)儀器及色譜柱要求較高，因此本實(shí)驗(yàn)中不予考慮。實(shí)驗(yàn)首先參考了2015年版中國(guó)藥典制川烏的HPLC含量測(cè)定方法對(duì)苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿3種成分進(jìn)行分析，即乙腈-四氫呋喃（25：15）-0.1 mol/L 醋酸銨（每1000 ml加入冰醋酸0.5 ml）梯度洗脫，結(jié)果表明，3種成分出峰時(shí)間較合適，分別為20，24，26 min，但峰型均較差，拖尾嚴(yán)重。其次，實(shí)驗(yàn)中嘗試乙腈-0.2 %醋酸（三乙胺調(diào)pH至6.2）體系進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，3種單酯型生物堿峰型有較大改善，對(duì)照品分離度均較好，但樣品分離度達(dá)不到要求，且分析過程中基線漂移，因此考慮將醋酸更換為磷酸以使基線穩(wěn)定。在本色譜體系中，僅加入磷酸不能出峰，必須加入少量的三乙胺后才能出峰，其原因可能是生物堿成分與色譜柱上的酸性硅醇基結(jié)合，不能被酸性流動(dòng)相洗脫下來，而加入三乙胺使流動(dòng)相呈一定的堿性，可使結(jié)合型的生物堿游離出來，被流動(dòng)相洗脫下來。雙烏止痛酊成分極其復(fù)雜，進(jìn)一步樣品分析過程表明，苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的分離度并不理想，因此嘗試稍微提高流動(dòng)相體系的堿性以改善分離度，比較pH 6.2，pH 6.5和pH 6.8 3種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，pH 6.5時(shí)分離效果最好。

3.3 樣品制備方法的選擇

在烏頭類生物堿含量測(cè)定中，文獻(xiàn)多采用先酸化再堿化，然后用氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑提取或萃取制備供試品溶液[7]，也有文獻(xiàn)采用丙酮沉淀[10]或C18小柱吸附法[11]等。雙烏止痛酊的處方組成十分復(fù)雜，制備工藝提取的成分極多，本實(shí)驗(yàn)采用先酸化酊劑再調(diào)pH堿化樣品使生物堿游離，最后以有機(jī)試劑萃取的方法制備供試品。實(shí)驗(yàn)中以3種單酯型生物堿的含量總和為指標(biāo)，考察了鹽酸濃度（0.05 %，1.0 %，2.0 %）、鹽酸用量（20，30，40 ml）、pH值（8，10，12）、萃取溶劑（氯仿、乙醚、乙酸乙酯）、溶劑用量（40，80，120 ml）及萃取次數(shù)（2，3，4次），結(jié)果表明，加入30 ml 2.0 %鹽酸后以氨水調(diào)pH至10，再以80 ml氯仿分3次萃取時(shí)效果最佳。采用乙酸乙酯萃取時(shí)，雜質(zhì)多，目標(biāo)峰峰型較差，而乙醚則提取不完全，目標(biāo)化合物含量顯著低于氯仿提取的樣品。而酸溶氯仿萃取的樣品色譜峰干擾稍少，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高。

4 小結(jié)

本文建立了雙烏止痛酊中制川烏、制草烏所含的3種單酯型生物堿的HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)2018年生產(chǎn)的10批樣品進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果表明，3種單酯型生物堿的總含量最低為34.78 μg/ml，最高為70.06 μg/ml，平均為52.02 μg/ml。根據(jù)2015版中國(guó)藥典規(guī)定的制川烏、制草烏中單酯型生物堿的含量范圍，按雙烏止痛酊的處方配比及制劑工藝轉(zhuǎn)移率進(jìn)行折算，制劑中單酯型生物堿的總含量應(yīng)在13.5～66.0 μg/ml范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)的10批樣品中有8批處于以飲片含量限度換算的范圍內(nèi)，2批樣品含量稍微超出最高限。

雙烏止痛酊中制川烏、制草烏既為處方中的有效成分同時(shí)也是毒性成分，其單酯型生物堿的含量對(duì)雙烏止痛酊的質(zhì)量與安全性會(huì)產(chǎn)生很大的影響，含量不達(dá)標(biāo)會(huì)降低臨床療效，含量超標(biāo)則可能引起中毒等不良反應(yīng)。在制劑生產(chǎn)過程中，飲片質(zhì)量、生產(chǎn)設(shè)備、制劑工藝等因素均可帶來制劑質(zhì)量的差異。本文首次對(duì)雙烏止痛酊中單酯型生物堿的總量進(jìn)行測(cè)定，補(bǔ)充并提升了其原有的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，為該制劑的全面質(zhì)量控制與臨床用藥安全提供一定依據(jù)。