雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1對腸道3型固有淋巴細(xì)胞功能的影響

劉健悅 ，沈 蕾

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海200025；2.上海市免疫學(xué)研究所，上海200025

3型固有淋巴細(xì)胞（group 3 innate lymphoid cell，ILC3）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類重要的免疫細(xì)胞亞群，主要富集在腸道黏膜組織，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)的孤兒核受體（retinoic acid receptor related orphan receptor，RORγt），并分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22（interleukin-22，IL-22）和IL-17[1-3]。ILC3表面缺乏抗原特異性受體的表達(dá)，在腸道中主要受細(xì)胞因子IL-23/IL-1β調(diào)控激活，在維持黏膜屏障完整性和抗病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。研究[6]表明，ILC3功能缺失或低下可導(dǎo)致腸道細(xì)菌感染。在小鼠中，ILC3可基于細(xì)胞表面標(biāo)志物趨化因子受體6（C-C motif chemokine receptor 6，CCR6）和天然細(xì)胞毒性受體（natural cytotoxicity triggering receptor，NCR，又稱NKp46）的差異表達(dá)劃分為不同亞群[7]。其中，CCR6+NKp46-ILC3是腸道淋巴組織發(fā)育所需的，可分泌IL-22和IL-17A；而共表達(dá)RORγt和T-bet（T-box transcription factor 21）的CCR6-NKp46+ILC3和CCR6-NKp46-ILC3主要分泌IL-22[8-9]。IL-22對于組織修復(fù)和宿主腸道組織抗細(xì)菌感染至關(guān)重要。一方面，IL-22信號可促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞間緊密連接的形成以及傷口愈合；另一方面，IL-22還調(diào)控與抗菌肽形成有關(guān)的基因表達(dá)以及上皮細(xì)胞的巖藻糖基化[10-13]。近年來，對ILC3發(fā)育和功能的研究越來越多，揭示了其在機(jī)體免疫中的重要性；但作為新興領(lǐng)域，仍有許多問題需要解決，關(guān)于ILC3穩(wěn)態(tài)及功能調(diào)節(jié)的相關(guān)研究仍具有重要意義。

雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）是一種進(jìn)化上高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）相關(guān)激酶家族，主要以2種復(fù)合體mTORC1（mTOR complex 1）和mTORC2的形式存在[14-15]。其中，關(guān)于mTORC1活化和功能的研究更為廣泛和透徹，其可整合生長因子、壓力、能量狀態(tài)及氧氣等多種胞內(nèi)外信號，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化和自噬等過程。mTORC1主要由Raptor（regulatory associated protein of mTOR）、mLST8（mTOR associated protein）、PRAS40（proline-rich Akt substrate 40 kDa）、DEPTOR（DEP domain containing mTOR interacting protein）以及mTOR分子組成，對雷帕霉素反應(yīng)敏感[16-18]。越來越多的研究表明mTORC1對免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能起著重要的調(diào)控作用。mTORC1可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子STAT（signal transducer and activator of transcription）家族成員從而決定CD4+T細(xì)胞的譜系分化，如Yang等[19]發(fā)現(xiàn)mTORC1的重要組分Raptor缺失后會導(dǎo)致Th2和Th17細(xì)胞分化受損，但不影響Th1細(xì)胞的分化。mTORC1還可通過作用于缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF1）和干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）促進(jìn)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的分化和功能[20]。在B細(xì)胞中，有研究[21]發(fā)現(xiàn)mTORC1功能被抑制后，B細(xì)胞增殖和漿細(xì)胞分化減弱，體液免疫應(yīng)答受損。此外，mTORC1還參與調(diào)節(jié)IL-23誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞中IL-22和IL-17的產(chǎn)生[22]。然而目前為止，關(guān)于mTORC1對固有淋巴細(xì)胞調(diào)控的研究仍很少。鑒于固有淋巴細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相似性，我們推測mTORC1在ILC3的發(fā)育維持和功能調(diào)控中也起著重要作用。

本研究先通過體外的雷帕霉素（rapamycin）抑制實驗探究mTORC1對ILC3功能的調(diào)控作用，然后構(gòu)建ILC3特異性mTORC1功能缺失的條件性敲除小鼠，檢測該小鼠腸道ILC3發(fā)育及功能的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本研究中所有小鼠均為C57BL/6背景，Rptorflox/floxRorcCre（Rptor為編碼Raptor蛋白的基因，Rorc為編碼RORγt蛋白的基因）小鼠由Rptorflox/flox小鼠和Rorccre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得，其中Rptorflox/flox小鼠受贈于中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)葉麗林教授課題組，Rorc-cre轉(zhuǎn)基因小鼠受贈于中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所邱菊教授實驗室。野生型C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物科學(xué)部的SPF級設(shè)施中，實驗動物使用許可證為SYXK（滬）2018-0027。除非本文另有說明，否則實驗用小鼠均為同窩6～8周齡雌鼠。所有動物實驗均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器抗CD3、CD45R（B220）、CD11b、CD11c、Ly-6G（lymphocyte antigen 6 complex，locus G）、CD45.2和IL-22的抗體均購自BioLegend公司（美國），抗RORγt、NK1.1（CD161）和CD90.2抗體購自eBioscience公司（美國），抗殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G1（killer cell lectin like receptor G1，KLRG1）抗體購自BD Biosciences公司（美國），蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A和細(xì)胞破膜固定液購自Thermo Fisher公司（美國），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司（美國），膠原酶Ⅷ和脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）購自Sigma Aldrich公司（美國）。另有試劑IL-23（R&D Systems，美國）、雷帕霉素（Selleck Chemicals，美國）、小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒（eBioscience，美國）、PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa，日本）、SYBR Green核酸熒光染料（Applied Biosystems，美國）。實驗中所用到的儀器主要有BD FACSAriaTMⅢ流式分選儀（BD Biosciences，美國）、BD LSRFortessaTMX-20流式分析儀（BD Biosciences，美國 ）、7500 Fast Real-time PCR儀（Applied Biosystems，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腸道固有層淋巴細(xì)胞的分離 小鼠脫頸處死后取出腸道，剝除上面附著的脂肪，剪去派氏結(jié)（Peyer′s patch），沿縱向剪開，放入磷酸鹽緩沖液（PBS）中震蕩清洗，去除糞便。之后剪成1～2 cm的小段，先放入含有1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的PBS中震蕩10 min，再轉(zhuǎn)移到含30 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的10 mL PBS中震蕩10 min。然后用含有0.05% DNaseⅠ和100 U/mL膠原酶Ⅷ的4 mL RPMI 1640培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)90 min。消化結(jié)束后劇烈晃動使組織細(xì)胞分散并用孔徑100 μm的細(xì)胞過濾器過濾，然后在室溫下以500×g離心20 min，從80%和40%Percoll梯度液的中間層收獲單個核細(xì)胞，得到腸道固有層淋巴細(xì)胞（lamina propria leukocyte，LPL）。

1.2.2 流式染色 得到的腸道LPL先按1:100加入Fc端封閉劑（CD16/32），4 ℃孵育10 min。細(xì)胞表面蛋白如CD3、CCR6、CD11b、CD45、CD11c等的染色按1:200比例稀釋抗體，4 ℃避光孵育30 min，然后PBS洗去抗體。對于細(xì)胞內(nèi)部蛋白如IL-22及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如RORγt的染色，先用小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒將細(xì)胞固定透化1 h，再按1:100比例稀釋胞內(nèi)抗體，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗去抗體，最后用200 μL PBS重懸細(xì)胞。過程中離心程序均為400×g，5 min。

1.2.3 實時熒光定量PCR 分選獲得的細(xì)胞先用TRIzol試劑抽提出RNA，檢測RNA濃度，并用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green試劑盒和不同的引物組進(jìn)行實時熒光定量PCR（real-time qPCR），每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，檢測程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)；60 ℃ 1 min。結(jié)果是相對于次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，Hprt）基因標(biāo)準(zhǔn)化的相對表達(dá)值，并根據(jù)2-ΔΔCT方法統(tǒng)計。實驗中所用到的引物序列見表1。

表1 Real-time qPCR引物Tab 1 Primer sequences for real-time qPCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗中的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料用±s表示；2組間差異的比較采用非配對Student′st檢驗計算。統(tǒng)計圖中所用樣本數(shù)據(jù)均來源于2個及以上獨立的實驗結(jié)果，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外雷帕霉素刺激抑制ILC3分泌IL-22

雷帕霉素是mTORC1信號通路的特異性抑制劑，對野生型C57BL/6小鼠腸道LPL用雷帕霉素體外刺激6 h，流式細(xì)胞分析檢測ILC3數(shù)量（RORγt+細(xì)胞）及IL-22的分泌情況。結(jié)果顯示0.1 mg/mL雷帕霉素處理后，ILC3比例及數(shù)量無變化，但分泌的IL-22明顯減少（圖1）；圖中也可觀察到RORγt陰性的非ILC3細(xì)胞IL-22產(chǎn)生能力不受影響，這提示mTORC1對ILC3功能具有調(diào)控作用。

圖1 雷帕霉素對ILC3分泌IL-22的抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of rapamycin on IL-22 secretion of ILC3

2.2 IL-23刺激后ILC3中Rptor mRNA水平表達(dá)上調(diào)

上述rapamycin刺激LPL實驗中，無法排除LPL中其他淋巴細(xì)胞對ILC3的干擾作用。故取6～8周齡野生型小鼠腸道LPL，借助流式分選技術(shù)獲取純化的ILC3。小鼠腸道ILC3的分選策略為：首先借助側(cè)向散射光（side scatter，SSC）去除成團(tuán)的細(xì)胞，然后根據(jù)前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）和SSC確定淋巴細(xì)胞亞群的位置，再利用譜系標(biāo)記（lineage marker）（CD3、B220、CD11b、CD11c、Ly-6G）定義出Lin-淋巴細(xì)胞群，之后通過CD45.2和CD90.2圈出CD45.2lowCD90.2high細(xì)胞群，ILC3主要集中在這一群中，最后使用KLRG1和NK1.1排除其中少量的ILC2及ILC1，得到純化的ILC3（圖2A）。對分選獲得的ILC3進(jìn)行RORγt表達(dá)水平的回測，結(jié)果證實分選得到的ILC3中RORγt陽性的比例達(dá)到90%以上（圖2B）。

IL-23是激活I(lǐng)LC3的主要上游信號，活化后的ILC3可分泌更多的IL-22等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)。將利用上述方法分選出來的ILC3用10 ng/mL IL-23刺激24 h，然后通過real-time qPCR檢測Rorc和Il22的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與已有的研究結(jié)果一致，這2種基因的mRNA表達(dá)均上調(diào)。結(jié)果還顯示，mTORC1的關(guān)鍵組成蛋白Raptor的mRNA表達(dá)水平也同步上調(diào)（圖2C）。上述結(jié)果提示，mTORC1可能在ILC3分泌IL-22的過程中起調(diào)控作用。

圖2 ILC3的純化及IL-23對其Rorc、Il22和Rptor mRNA表達(dá)的影響Fig 2 Purification of ILC3 and effect of IL-23 on Rorc, Il22 and Rptor mRNA expression

2.3 mTORC1功能缺失不影響小鼠腸道ILC3的數(shù)量

為了進(jìn)一步探究mTORC1在小鼠腸道ILC3中的作用，用Rptorflox/flox小鼠（下文簡稱為WT小鼠）與Rorc-cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，從而獲得只在表達(dá)RORγt的細(xì)胞中特異性敲除Rptor基因的小鼠Rptorflox/floxRorcCre（下文簡稱為KO小鼠），該小鼠是研究mTORC1功能缺失常用的工具小鼠。首先用real-time qPCR驗證Rptor的敲除效率，KO小鼠ILC3中RptormRNA表達(dá)水平顯著降低，說明條件性敲除小鼠構(gòu)建成功（圖3A）。

借助流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步分析小鼠結(jié)腸ILC3及ILC3中各亞群的比例及數(shù)量，發(fā)現(xiàn)WT小鼠和KO小鼠之間并無明顯差異（圖3B、C）。隨后，又比較了穩(wěn)態(tài)下WT小鼠和KO小鼠小腸及結(jié)腸長度和腸道派氏結(jié)的數(shù)量，仍無明顯差異（圖3D、E）。最后，通過蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，H-E染色）對比了WT小鼠和KO小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示特異性敲除Rptor后并未使穩(wěn)態(tài)下腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變（圖3F）。

圖3 KO小鼠與WT小鼠ILC3及ILC3中各亞群的比例及數(shù)量和腸道結(jié)構(gòu)觀察Fig 3 Ratios and numbers of ILC3 and ILC3 subsets and observation of intestinal structure in KO mice and WT mice

2.4 mTORC1功能缺失抑制ILC3分泌IL-22的能力

鑒于上述KO小鼠結(jié)腸的ILC3數(shù)量沒有發(fā)生變化，后續(xù)實驗檢測了KO小鼠結(jié)腸ILC3活化后分泌細(xì)胞因子的能力是否發(fā)生改變。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，在使用1 ng/mL IL-23刺激8 h后，相比WT小鼠，KO小鼠分泌IL-22的量顯著減少（圖4A），但分泌粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF）的能力不變（圖4B）。相應(yīng)地，在分選出WT小鼠和KO小鼠腸道ILC3后，使用1 ng/mL的IL-23刺激8 h，通過real-time qPCR檢測Il22mRNA及編碼GM-CSF的基因Csf2mRNA水平，結(jié)果與流式細(xì)胞分析結(jié)果一致（圖4C）。

圖4 Raptor缺失后ILC3分泌IL-22的能力Fig 4 Ability of ILC3 to secrete IL-22 after Raptor-deficiency

3 討論

腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持依賴于分布在腸黏膜上皮和固有層的各類免疫細(xì)胞協(xié)同作用。ILC3是近年來發(fā)現(xiàn)的一類免疫細(xì)胞亞群，主要富集于腸道黏膜組織，在腸道免疫穩(wěn)態(tài)和微生物防御中發(fā)揮重要作用[1-2]。在腸道生理穩(wěn)態(tài)下，共生微生物來源的相關(guān)信號首先促使巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等分泌IL-23和IL-1β，兩者作為ILC3的主要上游信號，可使ILC3活化并分泌細(xì)胞因子IL-22和IL-17A等；其中，IL-22被認(rèn)為對腸道屏障穩(wěn)態(tài)起著正向調(diào)控作用。IL-22主要參與促進(jìn)上皮細(xì)胞抗菌肽及黏液的生成、上皮細(xì)胞增殖和巖藻糖基化以及組織修復(fù)等過程，從而維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)[10-12]。研究[8]表明，ILC3中IL-22分泌缺失或低下可導(dǎo)致腸道細(xì)菌感染。ILC3和輔助性T細(xì)胞（Th17、Th22）均可產(chǎn)生IL22，但I(xiàn)LC3已被證實是腸道穩(wěn)態(tài)下IL-22的主要來源。關(guān)于ILC3中IL-22分泌的調(diào)控已有報道，主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，如芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，Ahr）及轉(zhuǎn)錄因子STAT3等都參與誘導(dǎo)IL-22的生成[23-24]，但仍存在很多未知的調(diào)控機(jī)制。

本研究先借助體外雷帕霉素刺激LPL實驗發(fā)現(xiàn)mTORC1對ILC3功能具有調(diào)控作用，又在IL-23刺激ILC3活化過程中觀察到編碼IL-22和mTORC1關(guān)鍵組分蛋白Raptor的基因mRNA表達(dá)水平同步上調(diào)，猜測mTORC1可能參與調(diào)控ILC3中IL-22的生成。通過構(gòu)建Rptorflox/floxRorcCre特異性基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)ILC3缺失Raptor后其分泌IL-22的能力受損，但并未影響小鼠結(jié)腸ILC3及ILC3亞群的數(shù)量，這說明mTORC1調(diào)控了ILC3的功能，但并未影響ILC3的發(fā)育。同時腸道穩(wěn)態(tài)下在KO小鼠中未觀察到腸道結(jié)構(gòu)損傷，這可能是由于腸道穩(wěn)態(tài)下IL-22分泌減少后機(jī)體內(nèi)存在其他代償機(jī)制。

綜上，本研究主要發(fā)現(xiàn)mTORC1功能缺失后導(dǎo)致ILC3分泌IL-22能力下降，鑒于IL-22在腸道抗微生物感染中的重要作用，提示mTORC1可能參與腸道穩(wěn)態(tài)維持和抗感染的過程。后續(xù)我們將通過鼠類檸檬酸菌感染模型進(jìn)一步驗證。另外，已有研究[25]發(fā)現(xiàn)mTOR依賴性的糖酵解等代謝程序調(diào)控了Th17細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。鑒于ILC3和Th17細(xì)胞之間的相似性，mTORC1對ILC3功能的調(diào)控是否也通過相關(guān)代謝通路仍需進(jìn)一步探究。