卡托普利對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞脂肪變性的影響*

唐新亞，侯 森，焦營營

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以彌漫性肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)沉積為主要病理，且無過量飲酒史。據(jù)報道，西方國家普通人群NAFLD患病率高達20%～30%，國內(nèi)患病率類似。NAFLD的發(fā)病機制尚未完全明確，可能與環(huán)境、遺傳、生活方式等因素密切相關(guān)[1，2]。目前，“二次打擊”學說已被認為是解釋該病發(fā)病機制較為成熟的觀點，胰島素抵抗(IR)會誘導肝細胞脂肪變性，致使肝臟脂肪沉積，以線粒體反應氧體系為核心的氧化應激和脂質(zhì)過氧化會加重肝臟損傷，引起肝臟炎癥反應。肝臟炎癥持續(xù)存在，誘導細胞因子和其它因素綜合作用，促使炎癥進展為肝組織壞死及纖維化，形成炎癥、壞死惡性循環(huán)[3，4]。有報道認為，以肝組織細胞色素氧化酶P4502E1(cytochrome P4502E1，CYP2E1)為中心產(chǎn)生的氧自由基和脂質(zhì)過氧化會誘導肝實質(zhì)損害，在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[5]?？ㄍ衅绽麑傺芫o張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，已被用于治療高血壓和紫癜性腎炎等疾病，在改善血糖代謝、增加胰島素敏感性、抗氧化應激、緩解放射性肺損傷等方面療效顯著[6，7]。本研究探討了卡托普利對NAFLD大鼠肝細胞脂肪變性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 健康雄性SD大鼠64只，SPF級，鼠齡為3～6個月，體質(zhì)量130～160 g，由湖北省疾控中心實驗動物中心提供。飼料級膽酸鈉、飼料級膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司)；卡托普利(四川太平洋藥業(yè)有限責任公司)；羅格列酮(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司)；檢測丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒(北京邦定生物醫(yī)學技術(shù)有限公司)，檢測谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，檢測血生化試劑盒(上海百祥生物科技有限公司)；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；聚合酶鏈反應(PCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；檢測肝組織CYP2E1引物(美國Santa Cruz公司)；DXC800型全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；720型超低溫冰箱(Thermo Scientific公司)；722型分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；Spectra Max M3酶標儀(Molecular Devices公司)；ABI-7300熒光定量PCR檢測儀(美國應用生物系統(tǒng)中國公司)；Gel DocTMEZ成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2 NAFLD大鼠模型的建立 隨機將64只大鼠分為4組，給予對照組普通飼料喂養(yǎng)，給予其他組高脂飼料(87.8%普通飼料+10%豬油+0.2%膽酸鈉+2%膽固醇)喂養(yǎng)，制備NAFLD大鼠模型。在造模第6 w，明確模型建立后，分別給予動物10 ml·kg-1生理鹽水(模型組)、卡托普利0.7 mg.100 g-1(卡托普利處理組)、羅格列酮0.047 mg.100 g-1(羅格列酮處理組)灌胃。持續(xù)給藥6 w，所有大鼠禁食12 h，給予1%戊巴比妥鈉0.4 ml.100 g-1腹腔注射麻醉，處死動物，取血和肝臟，稱量肝濕質(zhì)量，計算肝指數(shù)(=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。按組織質(zhì)量(g)∶乙醇體積(m1)=1∶9的比例，加入無水乙醇，冰水浴下勻漿、離心，收集上清液并保存。另留取部分肝組織，4%甲醛固定，行肝組織病理學檢查，將剩余的肝組織置入凍存管，置于液氮中短期保存。

1.3 肝組織CYP2E1 mRNA水平檢測 取肝組織0.1 g，于液氮中磨碎，提取總RNA，測定總RNA濃度和純度，確保D260/D280≥1.8。合成TIANScript cDNA第一鏈，行逆轉(zhuǎn)錄反應，分別加入CYP2E1和GAPDH基因引物行PCR反應，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像分析系統(tǒng)照相，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學表現(xiàn) 對照組肝細胞未見炎癥反應，無變性及壞死；模型組肝細胞體積增大，見廣泛性脂肪變性和細胞水腫；卡托普利處理組大部分肝細胞排列正常，可見少量脂肪變性，部分細胞水腫；羅格列酮處理組肝組織病理學變化類似于卡托普利處理組，但細胞內(nèi)脂滴較大，數(shù)量略增多(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現(xiàn)(HE， 200×) A：對照組，肝細胞正常，無炎癥反應；B：模型組，肝細胞廣泛性脂肪變性，出現(xiàn)炎癥反應；C：卡托普利處理組，肝細胞脂肪變性和炎癥程度明顯減輕；D：羅格列酮處理組，肝細胞脂肪變性和炎癥程度明顯減輕

2.2 各組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平比較 模型組血清AST、ALT、TC、TG顯著高于對照組(P<0.05)；卡托普利處理組、羅格列酮處理組血清AST、ALT、TC、TG顯著低于模型組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清指標比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.3 各組大鼠肝組織肝濕重和肝指數(shù)比較 模型組、卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝濕重、肝指數(shù)和肝組織CYP2E1 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，而卡托普利和羅格列酮處理組肝濕重和肝指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肝濕重和肝指數(shù)比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.4 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較 模型組血清MDA水平顯著高于，而血清GSH水平顯著低于對照組(P<0.05)，卡托普利和羅格列酮處理組血清MDA顯著低于，而血清GSH水平顯著高于模型組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血清MDA和GSH水平比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

3 討論

近年來，國內(nèi)非酒精性脂肪性肝病患病率呈逐年增長且年輕化趨勢，病因復雜，是多方面因素綜合作用的結(jié)果，其中RI、活性氧簇和氧應激、脂質(zhì)過氧化損傷、脂肪細胞因子、與脂肪酸代謝相關(guān)的細胞因子等在其發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[8，9]。目前，該病尚無特效治療，主要以運動、飲食和行為療法為主，藥物治療為輔，需要綜合性長期治療。卡托普利作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的代表藥，已被證實在原發(fā)性高血壓、充血性心力衰竭、急性肺栓塞等疾病治療中發(fā)揮著重要的作用，在治療大鼠肝損傷方面也具有顯著的療效，但目前鮮有報道分析卡托普利對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞脂肪變性的影響[10-12]。

本研究模型組肝濕重和肝指數(shù)增大，血清AST和ALT上升，血清TC和TG上升，血清MDA增多和血清GSH減少。在光鏡下觀察病理學表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝細胞體積增大，伴細胞水腫，肝細胞脂肪變，證實非酒精性脂肪性肝病大鼠造模成功。

本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組血清AST、ALT、TC和TG明顯低于模型組，與既往報道[13]相似，預示卡托普利可降低血清AST、ALT、TC和TG水平。非酒精性脂肪性肝病大鼠接受卡托普利干預后肝細胞損傷減輕，肝臟功能獲得明顯的改善，其機制可能是對肝細胞膜功能恢復有顯著的改善作用14，15]。卡托普利可通過減少非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質(zhì)在肝細胞內(nèi)的合成和沉積，改善脂代謝紊亂。本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝組織肝濕重和肝指數(shù)明顯低于模型組，卡托普利處理組動物大部分肝細胞排列正常，可見少量的脂肪變性和部分細胞水腫，證實卡托普利干預后肝細胞脂肪變性明顯改善，肝臟脂質(zhì)沉積狀況減輕。

本研究卡托普利處理組和羅格列酮處理組血清MDA明顯低于模型組，而血清GSH水平顯著高于模型組，證實卡托普利能有效減輕非酒精性脂肪性肝病大鼠機體氧化應激和脂質(zhì)過氧化程度，與以往報道[16]相似。MDA具有細胞毒性，可誘導細胞膜通透性及流動性改變，引起細胞結(jié)構(gòu)及功能損傷，誘導致炎因子大量釋放，與Kupffer細胞共同作用介導肝損傷[17]。GSH屬低分子抗氧化劑，可清除體內(nèi)自由基，維護細胞膜結(jié)構(gòu)及功能完整性，抗脂質(zhì)過氧化效果顯著，其血清含量反映了機體的抗氧化能力[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利處理組和羅格列酮處理組肝組織CYP2E1 mRNA水平顯著低于模型組，表明卡托普利可經(jīng)誘導YP2E1 mRNA水平下調(diào)，調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應激和脂質(zhì)過氧化[19,20]?？ㄍ衅绽赏ㄟ^降低非酒精性脂肪性肝病大鼠CYP2E1蛋白表達水平，減輕脂質(zhì)過氧化程度，緩解氧化應激反應，改善肝損傷。